Summary
マイクロ流体デバイスは、リアルタイムでかつ適切な物理的なスケールで複雑な自然のプロセスを可視化するために使用することができます。我々は地下で細菌の増殖と輸送を研究するための自然な多孔質媒体の主要な機能を模倣する簡単なマイクロ流体デバイスを開発しました。
Abstract
多孔質媒体中の微生物の増殖とトランスポートは、地下水および地表水、環境での栄養素のリサイクルだけでなく、直接のための飲料水に病原体の伝播の品質にとって重要な意味を持っている。天然多孔質媒体は複雑な物理トポロジ、様々な表面化学、栄養素と電子受容体の動的な勾配、および微生物の斑状分布で構成されています。これらの機能は、解釈が難しい微生物移動のマクロスケールの調査の結果を作る、ミクロンの長さスケールにより大きく変化すること、および機構モデルの検証は困難。ここでは、シンプルなマイクロ流体デバイスは、微細構造の生息地、微生物の相互作用を可視化するために観測された現象に影響を与える主要なプロセスを識別するために、そして体系的に予測モデルを検証するために使用することができる方法を示します。シンプルで使いやすいフローの細胞が透明な、生体適合性と酸素透過性材料ポリ（ジメチルシロキサン）で作られました。フォトリソグラフィーの標準的な方法は、微細構造のマスターを作るために使用され、レプリカの成形は、マスターから微細構造フローセルをキャストするために使用されました。フローセル室の物理的な設計は、実験的な要件に適応できる：マイクロチャネルは、単純な線形の接続から、複雑に変化することが2μmと小さいフィーチャサイズとトポロジ。私たちのモジュラーEcoChipフローセル配列は、重力駆動型フローモジュールで同一のチャンバーとフロー制御の数十しています。我々は、表面化学、流体特性、または微生物集団の特性の影響を調査している間EcoChipデバイスを使用することで、物理的な構造と圧力ヘッドは一定に保たまたは体系的に変えることができることを示している。非病原性を用いた輸送実験を通じ、緑の蛍光タンパク質発現
Protocol
I.マイクロ流体デバイスの作製
- マイクロ流体デバイスを作成する最初のステップは、コンピュータ支援図面（CAD）プログラムで、デバイスの2次元レイアウトを描画することです。このようなCleWinまたはFreehand、CorelDRAWーなどの、私たちはAutoCADを使用しているが、他の描画プログラムもご用意しています。
- 次のステップは、フォトリソグラフィマスクを製造することです。デバイスの寸法、必要な分解能と予算に応じて、これらのマスクは直接、高解像度のプリンタを使用してオーバーヘッドが透明に写真フィルム上に作成された、あるいは印刷された、クロム（最高解像度、高コスト）で作製することができます。ここでは、アドバンス模本（株）、マサチューセッツ州ノースアンドーバー製のCrマスクを使用している。
- 次のステップは発生レリーフ型を作成するために感光性エポキシの上にマスクからパターンを転送することです。
- 最初に、負のSU8フォトレジストの層が所望の厚さのシリコンウエハー上にスピンし、過剰の溶媒を揮発させる焼成する。フォトレジスト製剤およびスピン速度は堆積層の厚さを制御します。
- その後、パターンは、マスクを通してUV光の予め決められた用量にさらされています。ポスト露光ベーク架橋それらを不溶性フォトレジストコーティングの光にさらされる領域を、。
- 次は、未露光レジスト開発のステップは、正の発生レリーフ構造マスターと呼ばれるがままに、化学物質の開発者で除去されています。
- 第三ベーキングステップは、ハードベーク工程は、さらに構造を修正するためのオプションと呼ばれる。
- PDMSモールド
- 我々は、マイクロ流体デバイス1のレプリカの成形用のシリコーンエラストマー、ポリ（ジメチルシロキサン）を使用してください。最初に、基材は、硬化剤で10:1の重量比で混合し、このようなペトリ皿などの浅い容器にカビに注ぎ、そしてすべての目に見える泡がなくなるまで、真空下で脱気する。
- 未硬化PDMSとマスターを65で4時間以上のために慎重に水平にオーブンで発生するポリマーの架橋のためのCに配置されます。
- PDMSを固化された後、成形されたセクションは、ペトリ皿から切り出しています。穴が完成したデバイスのマイクロ流体空間をアクセスするために、デバイスの上部からパンチされています。
- ガラスへの添付
- クリーンPDMSは、不可逆的に酸素プラズマに暴露することによりガラスをきれいに接着されている。最初に、成形し、パンチPDMSときれいなガラスのスライドは、プラズマクリーナーに接着面を上に配置されます。我々は、PDC - 32G Harrickプラズマクリーナーを使用。
- チャンバーを閉じた後、オペレータは、無線周波数またはRFソースして真空ポンプをオンにして。プラズマは、自己室でわずかに紫色の輝きによって明らかなように、チャンバ内に点火されます。
- 30秒間プラズマに暴露した後、RF信号源とし、真空ポンプがオフになっています。
- 迅速に、スライドガラスとPDMS装置は、チャンバーから取り外し、直接接触（ダウン成形PDMSの表面側）に取り込まれます。これは不可逆的な結合を形成し、また、表面特性を親水性になります。
- 必要に応じて、異なる表面化学を吸着または共有結合によって表面上のタンパク質の固定化によってPDMSを達成することができます。
- デバイスは、その後脱イオン水、増殖培地、または毛管力や注射器を持つ穏やかな圧力を使用することにより、人工的な地下水などの流体を充填することができる。
II。重量分析によるマイクロ流体デバイスのフローの定量化
- デバイス内の圧力駆動流のキャリブレーションを行うには、微細構造のフローセルは、最初にDI水でプリロードされた。
- このようなプラスチック製注射器またはフローモジュールとして液体を含むリザーバは、（図1に示す）も上流の吸気口に接続されていて、貯水池内の流体の高さは十分下流での高さ以上に維持される。
- サンプルは定期的にも廃棄物を回収し、化学天秤で秤量する。
- 合計時間と合計量をプロットする曲線の傾きは、平均体積流量（図2）を与える。我々は、圧力ヘッドの幅広いと異なる圧力維持システムのための再現性、線形平均速度を発見した。
III。流れの可視化、速度のマッピング、および疎水性/親水性相互作用
- モデルのキャリブレーションの場合は、両方カルボキシYGと平野YG表面に3μmの蛍光ラテックスビーズはPolysciences社から入手した、0.01％の固形分の濃度に純水で希釈した。
- 生息地を流れるビーズはMightex BCE - B013 - Uモノクロカメラを搭載したツァイスAxiovert 25蛍光顕微鏡で可視化した。
- 個々のフレームは、矢継ぎ早に取り込まれ、ImageJのソフトウェアパッケージ（図3）と映画に組み立てられた。
IV。細菌の増殖とトランスポートのモデリングのためのマイクロ流体デバイス（EcoChip）
- ビブリオ 。 GFP館は、非病原性緑色蛍光タンパク質を発現する生物は約10 9細胞/ mlの濃度にルリア-ベルターニ培地で14時間増殖させた。
- 増殖培地中の細菌は、EcoChipデバイスに導入し、デバイスを植民地化し、19時間一晩フロックと映画を確立させた。
- その後、増殖培地をウェルから除去し、生息地のすべては、細菌の密度が異なるが、異なる生息地に残っていたように（ASWのレシピのためにWangら2を参照してください）人工海水でフラッシュした。
- 遅い流れの条件を3他の生息地内で維持されたまま一生息地は、フロー制御なしで密閉保管した。
- 細菌増殖の蛍光灯や白色光の画像は数日の期間（図4）ごとに15〜20時間を取られました。
V.代表の結果
フローモジュールは、複数の生息地を介してフローを規制し、配布するための簡単な手段を提供します。重量分析は、生息地と、入力と出力の井戸との間の圧力差の油圧抵抗に依存して生息地の構造、フロースルー率を決定するために簡単で直接的な方法であることが判明した。ビーズ流動実験のために我々はuncarboxylatedビーズ（図2）については、デバイスの面ではるかに大きいビーズ蓄積を観察している。さらに、大径のビーズ、6と10 mmは、はるかに小さい孔の開口部に運びとなり、デバイスに蓄積し始める可能性が高かった。速い流速は粒子保持と同調して減少。
細菌増殖の実験中に、流れの条件の影響は明らかである。連続的な剪断力は、細菌が一緒に集約し、フォームのフロックの原因、および個々の細胞として記載されていない。大規模な細菌フロックの輸送は、巨視的な系で勉強することは極めて困難である重要な環境プロセスです。
図1。フローモジュールの機能と動作を示す回路図。
図2。異なるカラムの高さの重量分析により決定される構造化された生息地を通過する流れの速度。列の高さの比率：60 / 40 = 1.5、決定した流量比：1.04 / 0.71 = 1.46。 H = 40 mmの結果、流速はV = 0.71μL/分であり、Hのために= 60 mmはV = 1.04、μL / minです。推定平均線速度3.1 mm / sにし、それぞれ4.6 mm / sになります。
図3とし、カルボキシル化は、構造化された生息地を流れることなく、3umラテックスビーズの輸送。
図4。細菌の増殖と遅い流れの存在下で種の密度の関数としてのバイオフィルム形成の変化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EcoChipシステムは、個々の実験のニーズに適応可能です。新しいマスターは、比較的容易に作成することができます、とマスターが作製されれば、必要に応じて、追加の正確に複製されたデバイスは、キャストすることができます。フローモジュールは、使用が簡単で、特別な装置や複雑な接続を必要とせず、シンプルな立ちヘッド圧力駆動流のシステムとしてモデル化することができます。この作品への追加の拡張が進行中であり、フミン酸のコーティングされたチャネルを作成し、体系的に流れる流体の水化学を変化させることが含まれます。このアプローチを使用して、多孔質媒体の表面と成長と輸送現象と細菌のミクロスケールの相互作用を直接観察し、体系的に検討することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この研究は、統合バイオシステム研究と教育のためのヴァンダービルト大学（VIIBRE）によって、およびサールシステムバイオロジーとバイオエンジニアリング学部研究経験（サールSyBBURE）で、国立科学財団から＃0649883助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | ||
| SU8-2025 | MicroChem Corp. | ||
| Fluorescent Beads | Polysciences, Inc. |
References
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).
