Fönster på en mikrovärld: Enkel mikroflödessystem system för att studera mikrobiella transport i porösa material

Summary

Mikroflödessystem enheter kan användas för att visualisera komplexa naturliga processer i realtid och på lämplig fysisk skalor. Vi har utvecklat en enkel mikroflödessystem enhet som härmar viktiga funktioner av naturliga porösa material för att studera tillväxt och transport av bakterier i ytan.

Abstract

Mikrobiell tillväxt och transport i porösa medier har viktiga konsekvenser för kvaliteten på grundvatten och ytvatten, återvinning av näringsämnen i miljön, samt direkt för överföring av patogener till dricksvatten. Naturliga porösa medier består av ett intrikat fysisk topologi, varierad yta kemier, dynamiska gradienter av näringsämnen och elektron acceptanter, och en ojämn fördelning av mikrober. Dessa funktioner varierar kraftigt över en längd skala från mikron, vilket gör resultaten från makronivå undersökningar av mikrobiell transport svårtolkade och validering av mekanistiska modeller utmanande. Här kan vi visa hur enkelt mikroflödessystem enheter kan användas för att visualisera mikrobiella interaktioner med mikro-strukturerade livsmiljöer, för att identifiera viktiga processer som påverkar den observerade fenomen, och att systematiskt validera prediktiva modeller. Enkel, lätt att använda flöde celler byggdes ut det genomskinliga, biokompatibla och syre-genomsläppligt material poly (dimetyl siloxan). Standardmetoder för fotolitografi användes för att göra mikro-strukturerade mästare, och replik gjutning användes för att kasta mikro-strukturerade flöde celler från mästarna. Den fysiska utformningen av flödescellen kammaren är anpassningsbar till den experimentella krav: mikrokanaler kan variera från enkel linjär kopplingar till komplexa topologier med funktionen storlekar så små som 2 ìm. Våra moduluppbyggda EcoChip flödescell rad funktioner dussintals identiska kammare och flödeskontroll med en gravitation driven flöde modul. Vi visar att genom användning av EcoChip enheter kan fysiska strukturer och huvuden trycket hållas konstant eller varieras systematiskt under påverkan av ytkemi, vätska egenskaper eller egenskaperna hos den mikrobiella populationen undersöks. Genom att transportera försök med en icke-patogena, grönt fluorescerande protein, som uttrycker

Protocol

I. mikroflödessystem enhet Fabrication

1. Det första steget i att skapa en mikroflödessystem enhet är att rita en tvådimensionell layout av enheten i en datorstödd ritning (CAD) program. Vi har använt AutoCAD, men andra ritprogram finns också, såsom CleWin eller CorelDraw.
2. Nästa steg är att tillverka en fotolitografiska mask. Beroende på enhetens storlek, krävs upplösning och budget, kan dessa masker att tillverkas i krom (högsta upplösningen, höga kostnader), som skapats på fotografisk film, eller ens skrivas ut direkt på en overhead öppenhet med hjälp av en högupplöst skrivare. Här har vi använt Cr masker tillverkade av Advance Reproduktioner Corp, North Andover, MA.
3. Nästa steg är att överföra mönstret från masken på en ljuskänslig epoxi för att skapa en upphöjd-lättnad mögel.
   1. För det första är ett lager av negativ SU8 fotoresist snurrade på en silikon wafer till önskad tjocklek, och bakade avdunsta överflödigt lösningsmedel. Fotoresist formulering och snurra hastigheter kontrollera tjockleken av det deponerade skiktet.
   2. Då är mönstret utsätts för en förutbestämd dos av UV-ljus genom masken. En post exponering bakar tvärbindningar ljuset exponerade områdena i fotoresist beläggning, som gör dem olösliga.
   3. Nästa är att utveckla steg, där oexponerad motstå tas bort med en kemisk utvecklare, vilket ger en positiv upp-lättnad struktur som kallas en mästare.
   4. En tredje bakning steget kallas en hård baka steg är valfritt att ytterligare fixa strukturer.
4. PDMS gjutning
   1. Vi använder poly silikon elastomer (dimetyl siloxan) för replik gjutning av mikroflödessystem enheter ^1. För det första är grundmaterialet blandas i ett 10:01 viktförhållande med härdare, hälls över mögel i en grund behållare t.ex. en petriskål och avgasade under vakuum tills alla synliga bubblor är borta.
   2. Befälhavaren med ohärdade PDMS placeras sedan i ett omsorgsfullt planat ugn i minst 4 timmar vid 65 ° C för förnätning av polymeren att uppstå.
   3. Efter PDMS är solidifierat är gjutna delen skurits ut ur petriskål. Hålen stansas genom toppen av enheten för att komma åt mikroflödessystem utrymmen i den färdiga produkten.
5. Tillägg till glas
   1. Ren PDMS är irreversibelt bundna till rent glas av exponering för syre plasma. Först är de gjutna och stansade PDMS och en ren glasskiva placeras bindning ytan upp i en plasma renare. Vi använde en PDC-32G Harrick plasma renare.
   2. När kammaren är stängd, vänder operatören på en vakuumpump och sedan radiofrekvens eller RF-källa. Plasma kommer självantända i kammaren, framgår av en något lila glöd i kammaren.
   3. Efter exponering för plasma i 30 sekunder, är RF-källa och sedan vakuumpumpen avstängd.
   4. Snabbt, är glasplatta och PDMS-enheten avlägsnas från kammaren och bringas i direkt kontakt (gjutna PDMS ytan nedåt). Detta kommer att utgöra en oåterkallelig bindning, och kommer också att göra ytegenskaper hydrofil.
   5. Om så önskas kan olika ytor kemier uppnås med PDMS genom immobilisering av proteiner på ytan genom adsorption eller kovalent bindning.
   6. Enheten kan sedan fyllas med vätska som avjoniserat vatten, odlingssubstrat, eller konstgjort grundvatten genom kapillärkrafter eller användning av lätt tryck med en spruta.

II. Flöde Kvantifiering av mikroflödessystem enhet med Gravimetrisk analys

1. Så här kalibrerar tryck-driven flöde i enheten var mikro-strukturerade flöde celler first förladdad med DI-vatten.
2. En vätska som innehåller reservoar, t.ex. en plastspruta eller flödet modulen (se figur 1) är ansluten till uppströms inloppet väl, och höjden av vätska i behållaren bibehålls över höjden på nedströms väl.
3. Prover samlas in på avfallet också med jämna mellanrum och värderas på ett analytiskt balans.
4. Lutningen på kurvan konspirera totala volymen kontra totala tiden ger den genomsnittliga flödet (figur 2). Vi har funnit reproducerbara, linjär genomsnittlig hastighet för ett brett spektrum av tryck huvuden och för olika tryck-underhålla systemen.

III. Flow Visualisering, Velocity Mapping, och hydrofila / Hydrophobic interaktion

1. För modell kalibrering var 3 ìm fluorescerande latex pärlor i både Karboxyterminerad YG och Plain YG ytor förvärvat från Polysciences, Inc. och var utspädd i DI-vatten till en koncentration av 0,01% fasta ämnen.
2. Pärlor strömmar genom livsmiljöer visualiseras på ett Zeiss Axiovert 25 fluorescensmikroskop utrustat med en Mightex BCE-B013-U monokrom kamera.
3. Enskilda bildrutor tillfångatogs i snabb följd och monteras in filmer med den ImageJ programvaran (Figur 3).

IV. Mikroflödessystem Device (EcoChip) för modellering bakterietillväxt och transport

1. Vibrio sp. GFP Kan, en icke-patogena grönt fluorescerande protein-uttryck organismen odlas för 14 timmar i Luria-Bertani medellång till en koncentration av ca 10 ⁹ celler / ml.
2. Bakterier i odlingsmedium infördes i EcoChip enheter och tillåts att kolonisera enheten och etablera flockar och filmer över natten för 19 timmar.
3. Då tillväxten media togs bort från brunnarna och alla de livsmiljöer spolas med konstgjort havsvatten (se Wang et al. ² för ASW recept) så att olika tätheter av bakterier fanns kvar i olika habitat.
4. En livsmiljö hölls förseglad med inget flöde, medan långsamma flöde bibehölls i 3 andra livsmiljöer.
5. Lysrör och vitt ljus bild av bakterietillväxt togs var 15-20 timmar för en period av flera dagar (Figur 4).

V. representativa resultat

Flödet modulen ger enkla medel för att reglera och fördela rinner genom flera olika livsmiljöer. Gravimetrisk analys visade sig vara ett enkelt och okomplicerat sätt att bestämma flöden genom livsmiljö strukturer, som beror på den hydrauliska motståndet i livsmiljöer och tryckskillnader mellan in-och brunnarna utgång. För pärla flödet experiment har vi sett mycket större pärla ackumulering vid enheten ytor för uncarboxylated pärlor (Figur 2). Dessutom var större diameter pärlor, 6 och 10 mm, mycket mer sannolikt att bli fångas i de mindre pore öppningar och börjar ansamlas i enheten. Snabbare flöden minskat partikel retention och ångan.

Under bakterietillväxt experiment, är påverkad av flöde tydligt. Kontinuerlig skjuvkrafter orsakar bakterier att samla ihop och flockarna form och inte finns med som enskilda celler. Transport av stora bakteriell flockar är en viktig miljöfråga process som är oerhört svårt att studera i ett makroskopiska system.

Figur 1. Schematisk som visar funktioner och drift av flödet modul.

Figur 2. Flödet genom strukturerade livsmiljö som bestäms av gravimetrisk analys för olika kolumnen höjder. Kolumn höjdförhållande: 60/40 = 1.5, bestäms flödeshastigheten ratio: 1,04 / 0,71 = 1,46. Resulterade flöden för H = 40 mm är V = 0,71 ml / min och för H = 60 mm är V = 1,04 μ L / min. Beräknade genomsnittliga linjära hastighet är 3,1 mm / s och 4,6 mm / s respektive.

Figur 3. Transport av 3um latex pärlor med och utan karboxylering rinner genom strukturerade livsmiljöer.

Figur 4. Förändring bakterietillväxt och biofilm bildas som en funktion av utsäde täthet i närvaro av en långsam flöde.

Discussion

Det EcoChip Systemet kan anpassas till behoven i ett enskilt experiment. Nya mästare kan skapas relativt enkelt, och när en herre är påhittade, kan ytterligare reproduceras exakt enheter kastas efter behov. Flödet Modulen är enkel att använda, kräver ingen speciell utrustning eller komplexa samband, och kan modelleras som en enkel fallande huvud tryck driven flödessystem. Ytterligare utökningar av detta arbete pågår, och bland annat skapa humussyra belagda kanaler och systematiskt varierande vattenfasen kemi strömmande vätska. Med denna metod kan mikro-skala interaktioner av bakterier med ytor och tillväxt och transporter fenomen i porösa medier observeras direkt och systematiskt undersökts.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning
SU8-2025	MicroChem Corp.
Fluorescent Beads	Polysciences, Inc.