Summary
このプロトコルは、上皮細胞や細菌の同時およびローカライズされた文化のためのマイクロ流体の共培養モデルを説明します。このモデルは、推定されるプロバイオティクス菌株の有効性を病因の異なる水溶性分子シグナルの役割を調べるだけでなく、画面に使用することができます。
Abstract
人間の胃腸（GI）管は、腸上皮細胞と非病原性（共生）細菌が共存するユニークな環境です。それは、病原体が共生層に遭遇する微小環境は、植民地化の程度を決定する上で重要であることが提案されている。病原体のコロニー形成を調べるための、現在の培養方法は、よく彼らは消化管の微小環境を模倣する方法で、細菌や上皮細胞の共培養を有効にしていないとしてこの仮説を調べるには適していません。ここでは、真核細胞や細菌の独立した文化を可能にするマイクロ流体共培養モデルを説明し、そして病原体の植民地で共生微環境の効果をテスト。共培養モデルは、共生を開発することにより実証される
Protocol
1。標準のSU - 8フォトリソグラフィー1（ このビデオでは図示せず ）を用いてシリコンのマスターの作製。
- 標準のSU - 8クリーンルーム内の異なるコンポーネント（異なる厚さのPDMS膜、共培養チャンバー）製造のためにSU - 8"マスター"（SU - 8 2050、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するためにフォトリソグラフィ法を使用してください。このようなマスターの金型は、任意の微細加工施設（;例えば、スタンフォードマイクロフルイディクス鋳造で作製することができるhttp://thebigone.stanford.edu/foundry/ ）。
- 前のPDMSの複製に、マスタからPDMSの簡単なリリースを容易にするために真空源に接続されたデシケーター中でフルオロシラン蒸気にSU - 8のマスターを公開。ペーパータオルにフルオロシランのドロップを追加し、1分間のために真空を適用する。真空を削除し、フルオロシランの堆積のための30分を許可する。 SU - 8今後の使用のために密閉容器に入れてマスターしてください。
2。マスタ2 SU - 8からPDMSのレプリカ成形
- 流体層と制御層は、SU - 8マスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。
- 午前10時01分重量でPDMSプレポリマーと架橋剤を混ぜる。 1時間（または気泡がPDMSの混合物から除去されるまで）のデシケーター中で比率とドガ。
- ペトリ皿のSU - 8マスターを置き、慎重にSU - 8のマスターの上にPDMSの混合物を注ぐ。再びドガPDMS。
- 金型で約100μmの均一なPDMSの厚さを得るために1分間1200rpmで金型を回転させる。
- PDMSを硬化するのに一時間PDMSと80 SU - 8のマスターモールド° Cを含むペトリ皿を加熱する。
- ホットプレートから硬化PDMS -覆われたSU - 8マスターを削除します。
- SU - 8マスターからPDMSモールドピール。
- two細菌の入口、一つの出口一空気圧ポートのために20ゲージの平滑末端針を用いてPDMSモールドの4つの穴を開けます。
3。多層PDMSデバイスのボンディング：このデバイスが3層、メインチャンネル、中央空気層、および細菌のためのチャネルが含まれている底の細菌層を含む最上位層で組み立てています。下記のように3つの層が組み立てられています。
- 清潔なピンセットを使用してSU - 8マスター金型からメタノールとし、慎重にはがしPDMS膜を濡らす。テフロンシート上に膜を置きます。
- 酸素プラズマチャンバで空気膜および流体層を配置。 40秒（酸素圧10 SCCM、RFパワー100W）のためにプラズマをオンにします。
- プラズマへの暴露後、（10分以内）鉗子を用いて底部PDMSチャネル上の膜の位置を合わせます。膜とPDMS層にメタノールを追加すると、レイヤーの自由な移動を支援し、アライメントが容易になります。この場合、デバイスはメタノール蒸気を逃がすためにガーゼに配置されます。
- 8時間80℃でホットプレート上に整列PDMS層を治す
- 結合するために集められた複合PDMSデバイス上に一番上のチャネルを3.4 - 底層に空気の膜を接着した後、手順3.2を繰り返します。
4。 PDMSデバイス3,4の組み立て
- 真核細胞と細菌を播種するために使用される入口側と出口側の穴を開けます。
- ポートにタイゴンチューブ（0.01インチOD）を接続し、20mlの注射器で引いて、空気の層を操作する。
- PDMSモデルと酸素プラズマチャンバ内に事前に洗浄したガラススライドを置きます。ためにプラズマをオンに真空を適用せずに20秒（酸素圧20 SCCM、RFパワー300W）。
- スライドガラスに島壁（PDMS）ボンディングとの間の接触を防ぐために、すぐにデバイスにシリンジを接続し、シリンジを引いて所定の位置に保持することにより真空を適用する。
- ゆっくりと（2分以内）ガラス上にPDMSモデルを押してください。
- 80℃PDMSデバイスを治す℃で10分間を。
5。フィブロネクチンでガラス表面を処理
- すべてのポートにタイゴンチューブを接続した後、15分間UVの下でデバイスを滅菌する。
- チャネル内のいずれかの破片を除去するためにチャネルに滅菌PBSを記入して流れます。気泡を除去するために10分間フローを適用します。空気の泡が簡単にするため、ガス透過性のPDMSをエスケープすることができます。
- チャンネル内の気泡の形成を防ぐために空気圧のチャンネルに色の色素溶液を埋める。
- ガラス上に真核細胞の播種を容易にするために、デバイスへのフィブロネクチンの1μg/ mLのソリューションを導入し、37℃で40分間インキュベート℃を
- 増殖培地1mLで過剰なフィブロネクチンを洗ってください。
6。共生E.の形成と測定大腸菌のバイオフィルムの島
- クローズドチャンバー/島の共生バイオフィルムを形成するためのOD 600までM9最少培地での共生細菌（例えば大腸菌 BW25113/pCM18）〜1に希釈する。
- 正の液圧を印加することにより、島の壁を閉じます。自家製対空液体圧力変換器は、チャネル内の気泡の形成を防ぐために使用されます。
- 共生E.を導入バルブを閉じた状態で島に大腸菌 、および細菌は32℃で1時間のために添付することができます℃に
- アタッチされていない細菌を洗い、12時間0.25mL/hrで希釈細菌懸濁液（OD 600〜0.05）を灌流。
- 緩やかに接続されている細菌を除去し、真核細胞の付着のために準備する新鮮なDMEM培養培地でバイオフィルムを洗浄します。
- 画像ライカTCS SP5共焦点レーザー走査顕微鏡（バノックバーン、イリノイ州）、およびIMARISソフトウェア5を使用してバイオフィルムのアーキテクチャを視覚化を使用してバイオフィルム。
7。細菌列島6月8日前後真核細胞を播種
- 5 × 10 5細胞/ mLの播種密度のためにDMEM培地で組織培養フラスコを再懸濁しますからHeLa細胞をトリプシン処理。
- Picoplusシリンジポンプ（ハーバードApparattus、MA）を用いて2 mL / minの流速で装置にHeLa細胞を導入する。島壁が細菌バイオフィルムは、HeLa細胞領域から独立しているように低下していることを確認してください。播種の均一性を決定することができるように、このステップは、光学顕微鏡のステージで実行する必要があります。
- 5％CO 2インキュベーターで37℃で6時間のためのチャネルとインキュベート° Cで細胞懸濁液の動きを減らすために、セルのコンセントをクランプする。
- アタッチされていないセルを削除するには、0.5mLの/ hrで増殖培地を使用してデバイスを灌流。
- リフレッシュHeLa細胞と共生E.ためのDMEM培地大腸菌 6時間ごと。
8。島と真核細胞への曝露への病原性細菌の導入
- E.を準備大腸菌 O157：H7（EHEC）は100:1 200:1（HeLa細胞あたりのEHECの数）の感染多重度（MOI）でHeLa細胞に感染する。
- リンスと緩く接続された共生細菌を洗い流す。
- 島々に希薄EHEC懸濁液（OD 600〜0.1）を導入する。
- ·フローなしで6時間、5％CO 2インキュベーター内でCが共生バイオフィルム内に存在する信号に公開されるEHECできるようにする37デバイスをインキュベートする。
- 6時間HeLa細胞に共生の島にEHECを公開するPDMSの壁を持ち上げて。
- PBSでチャンネルをすすぎ、ライブ/デッドキット（L3224、Invitrogen社、CA）を用いて生細胞と死細胞のために染色。
- ツァイスAxiovert 200M蛍光顕微鏡での画像の複数の場所をし、生細胞と死細胞の数を見積もります。
9。代表的な結果9
消化管感染症のイベントのシーケンスは、HeLa細胞の単層と共生E.を開発することによって、模倣された大腸菌のバイオフィルムと前のHeLa細胞の感染に共生バイオフィルムにEHECを公開。マイクロ流体共培養モデルの製造に必要な手順を図1に示します。 図2Aは、共培養装置の3次元レンダリングを示しています。共培養装置真核細胞培養チャンバーと細菌の島の2つの領域が異なる色の染料（細菌の島のための真核生物の領域と緑に紫）と図2Bに示されています。周囲の真核領域から細菌培養領域を単離する可能性は、色の染料を使用して、図2Cに示されています。 図3は、上皮細胞や細菌の共培養から代表的な結果を示す。 図3Aはによって共生バイオフィルム（緑）の島の植民地化を示していますEHEC（赤）。 図3Bは、上皮細胞と共生E.の並置を示しています。細菌の島のEHECと大腸菌 。 EHECとGFP発現共生細菌を表現するRFPは、上皮細胞から細菌の島を単離する可能性を示す、PDMS壁が低下して島にローカライズされています。
図1：共培養モデルにおける細胞播種方式 。 （1）PDMS壁が島を形成するために低下して、共生細菌は、島に導入され、そしてフィブロネクチンは、島の周りに流される。 （2）HeLa細胞は、島を囲む領域に播種されています。 （3）HeLa細胞がコンフルエントに達すると共生バイオフィルムが開発した後は、EHECが島に導入される。 （4）PDMS壁はリフトされていますEHECに島を取り巻くHeLa細胞を公開するまで。バルブ操作の挿入の詳細を示している。
図2：上皮細胞や細菌の共培養のためのマイクロ流体モデル 。上皮細胞間の細菌の島々を形成するための空気圧で作動トラッピング領域を示す共培養装置の（）三次元演出。各細菌の島（1200μmの径と間隔1000μmのは）増殖培地を提供し、島からの廃棄物を除去するための別の入口と出口を持っています。別の地域を（上皮細胞のゾーン、細菌の島々）を示す色の色素と共培養装置の（B）顕微鏡写真。 （C）空気トラッピングシステムの忠実度は、空気圧で活性化チャネル（青）を用いてPDMS壁を（左パネル）下げ閉島の島々に紫色の色素を導入し、48時間、その周囲に黄色の染料を流すことにより示されていますPDMS壁が（右のパネル）が発生したときに、島の地域は、周囲の黄色の染料にさらされている。スケールバーは500μmを表しています。
図3：HeLa細胞と細菌の共培養 。 RFPを発現しているEHECとGFP発現E.の（A）蛍光画像島の大腸菌 BW25113。 （B）送信のオーバーレイ、緑、およびデバイスの赤色蛍光画像。スケールバーは200μmを表しています。
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Discussion
病原体付着と植民地化のための従来のアッセイは、病原体が追加されるに組織培養プレート中の真核細胞の単層を利用する。これらのモデルは、真核細胞で開発された共生細菌バイオフィルムが内蔵されていないとして、生理学的に適切ではありません。真核細胞への事前成長細菌培養の単純な加算では、細菌の存在下での培養真核細胞に、バイオフィルムは時間をかけて開発する高度に組織化された構造体である、そしてそれは事実上不可能非常に困難であり、そうでない場合、このコンフォメーションにつながる可能性は低い生存率の有意な損失なしで長時間。病原体が上皮細胞に付着するためにこれらのモデルの共生バイオフィルムをナビゲートしていないため、これらのモデルは正確に消化管の上皮細胞と共生細菌の組織を模倣しない。ここで、我々は、真核細胞や細菌の共培養のために空気圧制御のトラップを使用するマイクロ流体デバイスの開発を概説する。モデルの病原体としてのモデル真核細胞株とEHECとしてHeLa細胞を用いて、我々は、共培養装置は、島の地域が分離のほか、HeLa細胞の単層と共生E.の育成と発展をサポートできることを示している大腸菌のバイオフィルム。マイクロ流体共培養モデルでは、共生細菌と上皮細胞の局在を可能にするだけでなく、上皮細胞が発生する前共生細菌に病原体を事前に公開するだけでなく、それによって、植民地化の間に多くの生理学的に関連する環境を提示する。さらに、共培養モデルでは、EHEC感染についてだけでなく、潜在的なプロバイオティクス菌株のスクリーニングなどのアプリケーションのための特定の信号の役割を調べるに焦点を当てた基礎的研究に有用なツールとなることができます。
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Acknowledgments
この作品は、国立科学財団（CBET 0846453）と国立衛生研究所（1R01GM089999）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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