Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Abstract

האדם במערכת העיכול (GI) בדרכי היא סביבה ייחודית שבה תאים אפיתל מעיים פתוגניים שאינם (commensal) החיידקים להתקיים. הוצע כי microenvironment כי הפתוגן נתקל בשכבה commensal חשוב בקביעת מידת קולוניזציה. שיטות התרבות נוכחי לחקירת קולוניזציה הפתוגן לא מתאימים היטב לחקירת השערה זו כאשר הם אינם מאפשרים שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אפיתל באופן המחקה את microenvironment מערכת העיכול. כאן אנו מתארים את מודל שיתוף microfluidic תרבות שמאפשרת תרבות עצמאית של תאים וחיידקים אוקריוטים, ובדיקת ההשפעה של microenvironment commensal על קולוניזציה הפתוגן. מודל שיתוף התרבות באה לידי ביטוי בפיתוח commensal

Protocol

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 ¹ (לא רואים בסרט הזה).

1. השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 "אדונים" (SU-8 2050, MicroChem, ניוטון, MA) בודה המרכיבים השונים (ממברנות PDMS של עובי שונות, שיתוף תרבות קאמרית) ב cleanroom. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 אדונים לאדים fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי.

2. Replica דפוס של PDMS מ SU-8 מאסטר ²

1. השכבה fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8.
2. מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה בתוך תא ייבוש עבור 1hour (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS).
3. מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8. דגה PDMS שוב.
4. ספין את התבנית על 1200 סל"ד במשך דקה אחת כדי לקבל עובי אחיד PDMS של כ 100μm על התבנית.
5. מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 ° C למשך שעה אחת כדי לרפא את PDMS.
6. הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 המאסטר של הכיריים.
7. פיל עובש PDMS ממורה SU-8.
8. מקדחה ארבעה חורים עובש PDMS באמצעות 20 הבוטה סוף מחט מד לשני פתחי הכניסה חיידקים, אחד לשקע אחד יציאת פנאומטי.

3. Bonding של Multilayer PDMS מכשירים: מכשיר זה מורכב עם שלוש שכבות, השכבה העליונה אשר מכיל את הערוץ העיקרי, שכבה פנאומטי הביניים, שכבת חיידקים התחתונה המכילה את הערוצים עבור חיידקים. שלוש שכבות מורכבים כמתואר להלן.

1. להרטיב את ממברנות PDMS עם מתנול בזהירות לקלף אותם SU 8-עובש שלהם לשלוט באמצעות מלקחיים נקיות. המקום קרום על גיליון טפלון.
2. מניחים את קרום פנאומטי ואת השכבה fluidic על תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה במשך 40 שניות (לחץ חמצן 10 SCCM, RF כוח 100W).
3. לאחר החשיפה פלזמה, ליישר (תוך 10 דקות) הממברנה על התחתונה PDMS הערוץ באמצעות מלקחיים. הוספת מתנול על הממברנה ואת שכבות PDMS עוזר תנועה חופשית של השכבות, ואינה יישור קל. במקרה זה, המכשיר ממוקם על פיסת גזה כדי לאפשר לאדים מתנול לברוח.
4. Cure PDMS שכבות מיושר על פלטה חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 8 ח
5. לאחר מליטה את הממברנה פנאומטי על השכבה התחתונה, חזור על שלבים 3.2-3.4 לקשר את הערוץ על גבי המכשיר התאספו PDMS מרוכבים.

4. הרכבת המכשיר PDMS ^3,4

1. לקדוח חורים הנמלים מפרצון ו לשקע המשמש זריעת התאים האיקריוטים וחיידקים.
2. חיבור צינורות Tygon (0.01 אינץ' OD) ליציאות ולהפעיל את השכבה פנאומטי ידי משיכת עם מזרק 20mL.
3. הנח את מודל PDMS ו שקופיות הזכוכית טרום ניקה לתוך תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה עבור מבלי להחיל את הוואקום 20 שניות (לחץ חמצן 20 SCCM, RF כוח 300W).
4. על מנת למנוע מגע בין הקיר מליטה (PDMS) באי לשקופית זכוכית, מיד לחבר מזרק למכשיר וליישם ואקום ידי משיכת מזרק מחזיק אותו במקומו.
5. לחץ בעדינות את המודל PDMS על גבי הזכוכית (תוך 2 דקות).
6. לרפא את המכשיר PDMS ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

5. טיפול משטח זכוכית עם פיברונקטין

1. לעקר המכשיר תחת UV למשך 15 דקות לאחר חיבור צינור ליציאת כל Tygon.
2. מילוי זרימת PBS מעוקרים לתוך התעלה כדי להסיר כל פסולת בערוץ. החל לזרום במשך 10 דקות כדי להסיר בועות אוויר. בועות האוויר יכול בקלות לחמוק PDMS בגלל חדירות הגז שלה.
3. פתרון מלא צבע צבע לתוך התעלה פנאומטי כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בערוץ.
4. כדי להקל על זריעת תאים אוקריוטים על הזכוכית, להכניס 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון של פיברונקטין לתוך המכשיר דגירה של 40 דקות בשעה 37 ° C.
5. שטפו את פיברונקטין עודף עם 1 מ"ל של התקשורת הצמיחה.

6. גיבוש ומדידה של commensal E. coli biofilm בהאיים

1. לדלל את החיידקים commensal (למשל, החיידק BW25113/pCM18) בכלי התקשורת M9 מינימלית OD ₆₀₀ ~ 1 לגיבוש biofilm commensal בתאי / איים סגור.
2. סגור את חומת האי על ידי יישום חיובי נוזל בלחץ. ממיר ביתי האוויר אל נוזל בלחץ משמש כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בערוץ.
3. להציג את ה commensal coli אל האיים עם שסתום סגור, מאפשרים לחיידקים לצרף במשך שעה 1 ב 32 ° C.
4. לשטוף את החיידקים פנויות ו perfuse השעיה חיידקי לדלל (OD ₆₀₀ ~ 0.05) בשעה 0.25mL/hr למשך 12 שעות.
5. שוטפים את biofilm עם טרי התקשורת DMEM צמיחה להסיר חיידקים רופף המצורפת ולהתכונן מצורף תא האיקריוטים.
6. תמונה biofilm באמצעות TCS Leica SP5 Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק (Bannockburn, אילינוי), ולדמיין את הארכיטקטורה biofilm באמצעות תוכנת IMARIS ^5.

7. מתזמן התאים האיקריוטים סביב האיים חיידקי ^6-8

1. Trypsinize תאים הלה מן הבקבוק רקמה תרבות resuspend ב DMEM מדיה צפיפות זריעה של 5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל.
2. הציגו את התאים הלה לתוך המכשיר בקצב הזרימה של 2 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק Picoplus (הרווארד Apparattus, MA). ודא קיר האי הוא הוריד כך biofilm חיידקי נפרד מאזור תא הלה. צעד זה צריך להתבצע על הבמה של מיקרוסקופ אור כך אחידות זריעת ניתן לקבוע.
3. הצמד ששקע התא כדי לצמצם את תנועת ההשעיה תא הערוץ דגירה של 6 שעות ב 37 מעלות של 5% CO ₂ באינקובטור.
4. Perfuse את המכשיר עם מדיום גידול של 0.5 מ"ל / שעה כדי להסיר תאים פנויים.
5. רענן התקשורת DMEM עבור הלה commensal E. coli כל 6 שעות.

8. מבוא של חיידקים פתוגניים לתוך האי וחשיפה התאים האיקריוטים

1. הכן E. coli O157: H7 (EHEC) להדביק תאים הלה על ריבוי של זיהום (moi) של 100:1 200:1 (מספר EHEC לכל תא הלה).
2. לשטוף לשטוף את החיידקים commensal רופף המצורפת.
3. הציגו את ההשעיה EHEC לדלל (OD ₆₀₀ ~ 0.1) לתוך האיים.
4. דגירה המכשיר 37 מעלות של 5% CO ₂ באינקובטור במשך 6 שעות ללא זרימה לאפשר EHEC להיחשף אותות נוכח biofilm commensal.
5. הרם את הקיר PDMS לחשוף EHEC באיים commensal לתאי הלה במשך 6 שעות.
6. יש לשטוף את הערוץ עם PBS ואת כתם על תאים חיים ומתים באמצעות ערכת Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA).
7. במקומות מרובים על תמונה מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 200 מיליון Zeiss ולהעריך את מספר התאים מת לחיות.

9. נציג תוצאות ⁹

רצף של אירועים זיהומים בדרכי העיכול היה חיקה ידי פיתוח monolayer של תאים הלה ו E. commensal coli biofilm וחשיפת EHEC כדי biofilm commensal לפני ההדבקה של תאים הלה. הצעדים מעורב בזיוף של מודל שיתוף תרבות microfluidic מוצגים באיור 1. 2A איור מראה טיוח 3 מימדי של המכשיר שיתוף התרבות. שני אזורים במכשיר שיתוף התרבות הקאמרית תרבית תאים אוקריוטים והאי חיידקי מוצגים 2B איור עם צבעים צבע שונה (סגול האזורים אוקריוטים וירוק עבור האי חיידקי). היתכנות של לבודד את האזורים התרבות חיידקים מאזור אוקריוטים שמסביב מוצג באיור 2C באמצעות צבעים צבע. איור 3 מציג תוצאות נציג מן התרבות המשותפת של תאים וחיידקים אפיתל. 3A איור מראה קולוניזציה של biofilm commensal (ירוק) על ידי אי EHEC (אדום). איור 3 ב מציג את הסמיכות של תאים אפיתל commensal E. coli עם EHEC באי חיידקי. RFP להביע EHEC וחיידקים GFP commensal להביע מרוכזים באי כאשר קיר PDMS מונמך, הממחישות את הכדאיות של בידוד חיידקי אי מתאי אפיתל.

איור 1: זריעת Cell תכנית במודל שיתוף התרבות. (1) הקיר PDMS הוא הוריד כדי ליצור אי, חיידקים commensal מוכנסים האי, פיברונקטין הוא זורם ברחבי האי. (2) תאים הלה הם זורעים באזורים המקיפים את האי. (3) אחרי תאים הלה להגיע למפגש ואת biofilm commensal פיתחה, EHEC מוחדר האי. (4) הקיר PDMS היא הרימהעד לחשיפת תאים הלה סביב האי EHEC. הבלעה מראה פרטי פעולת השסתום.

איור 2: מודל Microfluidic לתרבות משותפת של תאים וחיידקים אפיתל. (א) תלת ממדי הביצוע של המכשיר שיתוף התרבות מראה פניאומטית, ומונעת אזורים השמנה לגיבוש בין האיים חיידקי לתאי האפיתל. כל האי חיידקי (1200 בקוטר מיקרומטר ו 1000 מיקרומטר בנפרד) יש שקע כניסת נפרדת למתן התקשורת צמיחה הסרת פסולת מן האי. (ב) מיקרוסקופ של המכשיר שיתוף התרבות עם צבעים צבע מראה את האזורים השונים (אזור תא אפיתל, איים חיידקי). (ג) אמינות של מערכת השמנה פנאומטי מוצג על ידי הורדת קיר PDMS (פאנל משמאל) באמצעות ערוץ פניאומטית המופעל (כחול), מציגה צבע סגול לתוך האיים האי סגור, וזורם צבען צהוב סביב זה 48 ח כאשר קיר PDMS עולה (פאנל מימין), באזור האי חשוף צבען הצהוב שמסביב. בר סולם מייצג 500 מיקרומטר.

איור 3: עמית התרבות של תאים הלה וחיידקים. (א) תמונה פלואורסצנטי של RFP-לבטא EHEC ו-GFP להביע E. coli BW25113 באי. (ב) כיסוי של המועבר, ירוק, אדום ותמונות הקרינה במכשיר. בר סולם מייצג 200 מיקרומטר.

Discussion

מבחני קונבנציונלי עבור התקשרות קולוניזציה הפתוגן ולנצל monolayer של התאים האיקריוטים בצלחות בתרבית רקמה שאליו מתווספים פתוגנים. מודלים אלה אינם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הם לא לשלב biofilm חיידקי commensal שפותחה על התאים האיקריוטים. בנוסף פשוטים של תרבות טרום גדל חיידקים התאים האיקריוטים סביר להוביל קונפורמציה זו biofilms מאורגנים מאוד מבנים לפתח לאורך זמן, קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, אל התאים האיקריוטים תרבות בנוכחות חיידקים במשך פרקי זמן ארוכים ללא אובדן משמעותי הכדאיות. מאז פתוגנים לא לנווט biofilm commensal במודלים אלה לצרף לתאי האפיתל, דגמים אלה אינם לחקות במדויק את הארגון של תאים אפיתל commensal חיידקים במערכת העיכול. כאן, אנו מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic המשתמשת פניאומטית שבשליטת השמנה לתרבות משותפת של תאים וחיידקים האיקריוטים. שימוש בתאי הלה כמו קו מודל אוקריוטים התא EHEC כמו הפתוגן את המודל, אנו מראים כי המכשיר שיתוף התרבות יכול לשמור את האזור אי בודד, כמו גם לתמוך בטיפוח ופיתוח של monolayer תא הלה ו E. commensal coli biofilm. המודל microfluidic שיתוף התרבות לא רק מאפשר לוקליזציה של חיידקים ותאי אפיתל commensal, אלא גם מראש חושפת חיידקים פתוגנים commensal לפני המפגש לתאי האפיתל, ובכך, הצגת הסביבה הרלוונטית יותר פיזיולוגית במהלך הקולוניזציה. בנוסף, מודל שיתוף התרבות יכול להיות כלי שימושי עבור לימודי היסוד התמקד בחקירת תפקידו של אותות ספציפיים על infectivity EHEC כמו גם עבור יישומים כגון הקרנת זנים פרוביוטיים פוטנציאליים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SU-8 2050	MicroChem Corp.
high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask	Fineline-Imaging Inc, CO
Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	77279
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30002.02
Programmable spin coater	Laurell Tech Corp	WS0650S
Mask aligner	Neurotronix	Q4000
Oxygen plasma etcher	March Plasma System, CA	CS-1701
Syringe pump	Harvard Apparatus
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L-3224