Este protocolo descreve um modelo de co-cultura microfluídicos para a cultura simultânea e localizada de células epiteliais e bactérias. Este modelo pode ser usado para investigar o papel dos diferentes sinais moleculares solúveis na patogênese, bem como tela a eficácia do suposto probiótico cepas bacterianas.
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Artigo de método
Microfluídicos Co-cultura de células epiteliais e bactérias para a Investigação Solúvel sinal mediada por interações
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ser humano no trato gastrointestinal (GI) é um ambiente único em que células do epitélio intestinal e não-patogênicos (comensais) bactérias coexistem. Tem sido proposto que o microambiente que o patógeno encontra na camada de comensais é importante para determinar a extensão da colonização. Métodos de cultura atual para investigar a colonização de patógenos não são adequados para investigar esta hipótese, pois não permitem co-cultura de bactérias e células epiteliais de uma forma que imita o microambiente do trato GI. Descrevemos aqui um modelo de co-cultura microfluídicos que permite que a cultura independente de células eucarióticas e bactérias, e testar o efeito do microambiente comensais sobre a colonização do patógeno. O modelo de co-cultura é demonstrada através do desenvolvimento de um comensal
Protocolo
1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão 1 (não é mostrado neste vídeo).
- Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 "mestres" (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) para a fabricação de diferentes componentes (membranas PDMS de diferentes espessuras, co-cultura câmara) em uma sala limpa. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 mestres de vapor fluorosilane em um ....
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Discussão
Ensaios convencionais para fixação e colonização de patógenos utilizam uma monocamada de células eucarióticas em placas de cultura de tecido em que os patógenos são adicionados. Estes modelos não são fisiologicamente relevantes como eles não incorporam um biofilme bacteriano comensais desenvolvida em células eucarióticas. Simples adição de uma cultura pré-grown bacteriana às células eucarióticas é improvável que levam a essa conformação como biofilmes são estruturas altamente organizadas que se desenvolvem ao longo do t.......
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Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte pelo National Science Foundation (CBET 0.846.453) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R01GM089999).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| máscara de fotolitografia de alta resolução (16.256 dpi) | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Tricloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctil)silano | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| centrífuga programável | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| alinhamador de máscara | Neurotronix | Q4000 | |
| gravador a plasma de oxigênio | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| bomba de seringa | Harvard Apparatus | ||
| Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Live/Dead | Invitrogen | L-3224 |
Referências
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves....
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Reimpressões e permissões
