Summary
Este protocolo descreve um modelo de co-cultura microfluídicos para a cultura simultânea e localizada de células epiteliais e bactérias. Este modelo pode ser usado para investigar o papel dos diferentes sinais moleculares solúveis na patogênese, bem como tela a eficácia do suposto probiótico cepas bacterianas.
Abstract
O ser humano no trato gastrointestinal (GI) é um ambiente único em que células do epitélio intestinal e não-patogênicos (comensais) bactérias coexistem. Tem sido proposto que o microambiente que o patógeno encontra na camada de comensais é importante para determinar a extensão da colonização. Métodos de cultura atual para investigar a colonização de patógenos não são adequados para investigar esta hipótese, pois não permitem co-cultura de bactérias e células epiteliais de uma forma que imita o microambiente do trato GI. Descrevemos aqui um modelo de co-cultura microfluídicos que permite que a cultura independente de células eucarióticas e bactérias, e testar o efeito do microambiente comensais sobre a colonização do patógeno. O modelo de co-cultura é demonstrada através do desenvolvimento de um comensal
Protocol
1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão 1 (não é mostrado neste vídeo).
- Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 "mestres" (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) para a fabricação de diferentes componentes (membranas PDMS de diferentes espessuras, co-cultura câmara) em uma sala limpa. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 mestres de vapor fluorosilane em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo para facilitar a liberação fácil de PDMS do mestre. Adicionar uma gota de fluorosilane para uma toalha de papel e aplicar vácuo para uma min. Remova a vácuo e aguarde 30 min para a deposição de fluorosilane. Mantenha o mestre SU-8 em um recipiente fechado para uso futuro.
2. Moldagem réplica de PDMS de SU-8 master 2
- A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 master.
- Misture o PDMS pré-polímero e cross-linker em um wt 10:01. relação e desgaseificar em secador durante uma hora (ou até que as bolhas de ar são removidos da mistura de PDMS).
- Coloque o mestre-8 SU numa placa de Petri e cuidadosamente despeje a mistura PDMS em cima do mestre SU-8. Degas do PDMS novamente.
- Girar o molde a 1200 rpm por um minuto para obter uma espessura uniforme de cerca de PDMS 100μm sobre o molde.
- Aqueça a placa de petri contendo o PDMS eo SU-8 molde mestre em 80 ° C por uma hora para curar o PDMS.
- Remover o curado PDMS coberto SU-8 mestre do fogão.
- Descasque o molde PDMS do mestre SU-8.
- Faça quatro furos no molde PDMS usando uma agulha de calibre 20 blunt-end para duas entradas bactérias, uma saída e uma porta pneumática.
3. Colagem de Multilayer PDMS dispositivos: Este dispositivo é montado com três camadas, uma camada superior que contém o canal principal, uma camada pneumática meio, e uma camada inferior de bactérias que contém os canais para as bactérias. As três camadas são montados conforme descrito abaixo.
- Molhar as membranas PDMS com metanol e cuidadosamente descascá-los de seus SU-8 molde mestre usando uma pinça limpa. Membrana lugar em uma folha de teflon.
- Coloque a membrana pneumática ea camada fluídica em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue plasma por 40 segundos (pressão de oxigênio 10 sccm, RF potência de 100W).
- Após a exposição ao plasma, alinhar (10 minutos) da membrana na parte inferior PDMS canal usando o fórceps. Adição de metanol na membrana e as camadas de PDMS ajuda a livre circulação das camadas, alinhamento e torna mais fácil. Neste caso, o dispositivo é colocado em um pedaço de gaze para permitir que os vapores de metanol para escapar.
- Cure as camadas alinhadas PDMS numa placa de aquecimento a 80 ° C por 8 h.
- Após a colagem da membrana pneumática para a camada inferior, repita os passos de 3,2-3,4 para unir o canal superior para o dispositivo montado PDMS composto.
4. A montagem do dispositivo de PDMS 3,4
- Faça furos nos portos de entrada e saída usado para semeadura células eucarióticas e bactérias.
- Conecte a tubulação de Tygon (0,01 polegadas OD) para os portos e operam na camada pneumática, puxando com uma seringa de 20 mL.
- Coloque o modelo PDMS e uma lâmina de vidro pré-limpeza em uma câmara de plasma de oxigênio. Ligue plasma por 20 segundos (pressão de oxigênio 20 sccm, RF potência de 300W) sem aplicar o vácuo.
- , A fim de evitar o contacto entre a parede ilha de ligação (PDMS) para a lâmina de vidro, imediatamente se conectar uma seringa para o dispositivo e aplicar vácuo puxando a seringa e mantê-lo no lugar.
- Pressione suavemente o modelo PDMS no vidro (2 minutos).
- Cure o dispositivo PDMS a 80 ° C por 10 minutos.
5. Tratar a superfície de vidro com fibronectina
- Esterilizar dispositivo sob UV por 15 minutos depois de conectar tubos Tygon para cada porta.
- Preenchimento e fluxo da PBS esterilizado para o canal para remover quaisquer detritos no canal. Aplicar o fluxo por 10 minutos para remover bolhas de ar. As bolhas de ar podem facilmente escapar do PDMS por causa de sua permeabilidade ao gás.
- Preencher uma solução corante de cor no canal pneumático para prevenir a formação de bolhas de ar no canal.
- Para facilitar a semeadura célula eucariótica no vidro, introduzir uma solução a 1 mg / mL de fibronectina no dispositivo e incubar por 40 min a 37 ° C.
- Lavar o excesso de fibronectina com 1 mL de meio de crescimento.
6. Formação e medição de comensais E. biofilme em Escherichiailhas
- Diluir as bactérias comensais (eg, E. coli BW25113/pCM18) em media M9 mínimos para OD 600 ~ 1 para a formação de um biofilme comensais nas câmaras fechadas / ilhas.
- Feche a parede ilha, aplicando-líquido positivo de pressão. Um conversor de pressão caseira ar-líquido é usado para prevenir a formação de bolha de ar no canal.
- Introduzir o E. comensais coli nas ilhas com a válvula fechada, e permitir que as bactérias para anexar por 1 hora a 32 ° C.
- Lave as bactérias solto e perfundir uma suspensão bacteriana diluída (OD 600 ~ 0,05) em 0.25mL/hr por 12 horas.
- Lavar o biofilme com a mídia crescimento fresco DMEM para remover bactérias fracamente ligados e se preparar para fixação das células eucarióticas.
- A imagem do biofilme usando uma Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope (Bannockburn, IL), e visualizar a arquitetura do biofilme usando o software IMARIS 5.
7. Semeadura células eucarióticas em torno de ilhas bacteriana 6-8
- Trypsinize células HeLa do frasco de cultura de tecidos e ressuspender em DMEM mídia para uma densidade de semeadura de 5 x 10 5 células / mL.
- Introduzir células HeLa no dispositivo a uma vazão de 2 mL / min usando uma bomba de seringa Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Certifique-se que a parede ilha é reduzida para que o biofilme bacteriano é separada da região de células HeLa. Esta etapa deve ser realizada no palco de um microscópio de luz para que a uniformidade de semeadura pode ser determinada.
- Grampo da tomada de célula para reduzir o movimento da suspensão de células no canal e incubar por 6 horas a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2.
- Perfundir o dispositivo com o meio de crescimento de 0,5 mL / hr para remover as células acopladas.
- Atualizar os meios de comunicação DMEM para HeLa e E. comensais coli a cada 6 horas.
8. Introdução de bactérias patogênicas na ilha e exposição a células eucarióticas
- Prepare E. coli O157: H7 (EHEC) para infectar as células HeLa em uma multiplicidade de infecção (moi) de 100:1 200:1 (número de EHEC por célula HeLa).
- Enxaguar e lavar fracamente ligados bactérias comensais.
- Introduzir uma suspensão diluída EHEC (OD 600 ~ 0,1) para as ilhas.
- Incubar dispositivo a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 por 6 horas sem fluxo para permitir a EHEC ser exposto a sinais presentes no biofilme comensais.
- Levantar o muro PDMS para expor EHEC nas ilhas comensais às células HeLa por 6 horas.
- Lave o canal com PBS e mancha para as células vivas e mortas utilizando o kit Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA).
- Locais de várias imagens em um microscópio Zeiss 200M Axiovert fluorescência e estimar o número de células vivas e mortas.
9. Resultados representativos 9
A seqüência de eventos em infecções do trato GI foi imitado pelo desenvolvimento de uma monocamada de células HeLa e um comensal E. biofilme coli e expondo EHEC para o biofilme comensais antes da infecção de células HeLa. As etapas envolvidas na fabricação do modelo de co-cultura microfluídicos são mostrados na Figura 1. Figura 2A mostra uma renderização 3-dimensional do dispositivo co-cultura. As duas regiões no dispositivo de co-cultura da câmara de cultura de células eucarióticas e da ilha de bactérias são mostrados na Figura 2B com tintas de cores diferentes (roxo para as regiões eucarióticas e verde para a ilha de bactérias). A viabilidade de isolar as regiões cultura bacteriana da região envolvente eucarióticas é mostrado na Figura 2C usando corantes. Figura 3 mostra os resultados representante da co-cultura de células epiteliais e bactérias. Figura 3A mostra a colonização do biofilme comensais (verde) por ilha EHEC (vermelho) Figura. 3B mostra a justaposição das células epiteliais e E. comensais coli com EHEC na ilha bacteriana. O RFP expressando GFP EHEC e expressando bactérias comensais estão localizadas na ilha quando a parede PDMS é reduzida, ilustrando a viabilidade de isolar a ilha de bactérias a partir de células epiteliais.
Figura 1: esquema de celular semeadura no modelo de co-cultura. (1) A parede PDMS é reduzido para formar uma ilha, bactérias comensais são introduzidos na ilha, e fibronectina é corria ao redor da ilha. (2) células HeLa são semeados nas regiões que cercam a ilha. (3) Depois de células HeLa atingir confluência e do biofilme comensais se desenvolveu, EHEC é introduzido na ilha. (4) A parede PDMS é levantadaaté expor as células HeLa em torno da ilha para EHEC. Inset mostra detalhes do funcionamento da válvula.
Figura 2: Modelo microfluídicos para co-cultura de células epiteliais e bactérias. (A) versão tridimensional do dispositivo co-cultura mostrando-pneumaticamente acionada regiões armadilhas para a formação de ilhas de bactérias entre as células epiteliais. Cada ilha bacteriana (1200 mm e diâmetro de 1.000 M de distância) tem uma entrada separada e saída para fornecer meios de crescimento e remoção de resíduos da ilha. (B) Micrografia do dispositivo co-cultura com tintas de cores mostrando as diferentes regiões (zona de células epiteliais, ilhas bacteriana). (C) A fidelidade do sistema de captura pneumático é mostrado através da redução da parede PDMS (painel esquerdo) usando um canal de pneumaticamente ativada (azul), introduzindo a tintura roxa nas ilhas fechadas ilha, e fluindo corante amarelo em torno dele por 48 h. Quando a parede é levantada PDMS (painel direito), a região insular é exposta ao corante amarelo ao redor. Barra de escala representa 500 mm.
Figura 3: Co-cultura de células HeLa e bactérias. (A) imagem de fluorescência de RFP-expressando GFP-EHEC e expressando E. coli BW25113 na ilha. (B) Sobreposição de transmissão, verde e vermelho imagens de fluorescência no dispositivo. Barra de escala representa 200 mM.
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Discussion
Ensaios convencionais para fixação e colonização de patógenos utilizam uma monocamada de células eucarióticas em placas de cultura de tecido em que os patógenos são adicionados. Estes modelos não são fisiologicamente relevantes como eles não incorporam um biofilme bacteriano comensais desenvolvida em células eucarióticas. Simples adição de uma cultura pré-grown bacteriana às células eucarióticas é improvável que levam a essa conformação como biofilmes são estruturas altamente organizadas que se desenvolvem ao longo do tempo, e é extremamente difícil, se não impossível, para as células eucarióticas em cultura a presença de bactérias por longos períodos de tempo sem perda significativa da viabilidade. Uma vez que os patógenos não navegar através de um biofilme comensais nesses modelos para ligar às células epiteliais, estes modelos não precisa imitar a organização das células epiteliais e bactérias comensais no trato GI. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um dispositivo micro que usa pneumaticamente controlada sem armadilhas, para co-cultura de células eucarióticas e bactérias. Usando células HeLa como a linha de células eucarióticas e EHEC modelo como o patógeno modelo, vamos mostrar que o dispositivo de co-cultura pode manter a região isolada ilha, bem como apoiar o cultivo e desenvolvimento de uma monocamada de células HeLa e um comensal E. biofilme coli. O modelo de co-cultura microfluídicos não só permite a localização de bactérias comensais e células epiteliais, mas também expõe pré-patógenos de bactérias comensais antes de encontrar células epiteliais; assim, apresentando um ambiente mais fisiologicamente relevantes durante a colonização. Além disso, o modelo de co-cultura pode ser uma ferramenta útil para estudos fundamentais focado em investigar o papel de sinais específicos sobre a infectividade EHEC, assim como para aplicações como rastreamento potencial cepas probióticas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo National Science Foundation (CBET 0.846.453) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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