Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine mikrofluidische Co-Kultur-Modell für die gleichzeitige und lokalisierte Kultur von Epithelzellen und Bakterien. Dieses Modell kann zur Untersuchung der Rolle der verschiedenen löslichen molekularen Signalen auf Pathogenese sowie Bildschirm die Wirksamkeit der vermeintlichen probiotischen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Abstract
Der menschliche Magen-Darm (GI-Trakt) ist ein einzigartiges Umfeld, in dem intestinalen Epithelzellen und nicht-pathogenen (Kommensalen) Bakterien koexistieren. Es wurde vorgeschlagen, dass die Mikroumgebung, dass der Erreger Begegnungen in der kommensalen Schicht wichtig bei der Bestimmung der Ausdehnung der Besiedlung ist. Aktuelle Kultur Methoden zur Untersuchung von Krankheitserregern Kolonisation sind nicht gut für die Untersuchung dieser Hypothese, da sie nicht aktivieren Co-Kultur von Bakterien und Epithelzellen in einer Weise, dass die GI-Trakt Mikroumgebung imitiert geeignet. Hier beschreiben wir einen mikrofluidischen Co-Kultur-Modell, das unabhängig Kultur von eukaryotischen Zellen und Bakterien ermöglicht, und die Prüfung der Wirkung der kommensalen Mikroumgebung auf Erreger Kolonisation. Die Co-Kultur-Modell ist durch die Entwicklung eines Kommensalen nachgewiesen
Protocol
1. Herstellung von Silizium-Master mithilfe von Standard-SU-8 Photolithographie 1 (nicht in diesem Video gezeigt).
- Verwenden Sie Standard-SU-8 Photolithographie Methoden, um eine SU-8 "Meister" (SU-8 2050 MicroChem, Newton MA) für die Herstellung der verschiedenen Komponenten (PDMS-Membranen mit unterschiedlicher Dicke, Co-Kultur-Kammer) in einem Reinraum. Erstellen Solche Master-Formen können jederzeit Mikrofabrikation Anlage (, z. B. Stanford Mikrofluidik Foundry hergestellt werden http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Vor PDMS-Replikation, setzen die SU-8 Meister Fluorsilan Dampf in einem Exsikkator an einem Vakuum-Quelle auf einfache Veröffentlichung von PDMS aus dem Master zu erleichtern. Einen Tropfen Fluorsilan auf ein Papiertuch und gelten Vakuum für eine min. Entfernen Sie das Vakuum und damit 30 min für die Abscheidung von Fluorsilan. Halten Sie die SU-8-Master in einem geschlossenen Behälter für die zukünftige Verwendung.
2. Replica Formen von PDMS von SU-8 Master 2
- Die fluidische Schicht und die Kontrolle Schicht durch Replikat des PDMS von SU-8 Master gemacht.
- Mix der PDMS-pre-Polymer und Vernetzer bei einem 10:1-wt. Verhältnis und Degas in einem Exsikkator für 1 Std. (oder bis Luftblasen aus der PDMS-Mischung entfernt).
- Legen Sie die SU-8 Master in einer Petrischale und vorsichtig gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Oberseite des SU-8-Master. Degas die PDMS wieder.
- Spin der Form bei 1200 rpm für eine Minute, um ein einheitliches PDMS Dicke von etwa 100 um auf die Form zu bekommen.
- Erhitzen Sie die Petrischale mit dem PDMS und der SU-8 Master-Form bei 80 ° C für eine Stunde auf dem PDMS zu heilen.
- Entfernen Sie das gehärtete PDMS-bedeckten SU-8-Meister aus der Heizplatte.
- Schälen Sie die PDMS Form aus dem SU-8-Master.
- Bohren Sie vier Löcher in die PDMS Form mit Hilfe einer 20-Gauge-blunt-end Nadel für zwei Bakterien Buchten, eine Steckdose und eine pneumatische Port.
3. Kleben von Multilayer PDMS-Geräte: Das Gerät ist mit drei Schichten, eine obere Schicht, die den Hauptkanal, einen Mittelweg pneumatische Schicht und einer unteren Schicht bakterielle, dass die Kanäle für die Bakterien enthält enthält montiert. Die drei Schichten zusammengesetzt sind, wie unten beschrieben.
- Wet die PDMS-Membranen mit Methanol und sorgfältig schälen sie aus ihren SU-8 Master-Form mit einem sauberen Pinzette. Legen Membran auf einem Teflon-Folie.
- Legen Sie die pneumatische Membran und die Fluidik-Schicht auf einer Sauerstoff-Plasma-Kammer. Schalten Sie Plasma für 40 sec (Sauerstoffdruck 10 sccm, HF-Leistung 100 W).
- Nach Exposition gegenüber Plasma, align (innerhalb von 10 Minuten) der Membran auf der Unterseite PDMS-Kanal mit einer Pinzette. Zugabe von Methanol auf der Membran und der PDMS-Schichten hilft Freizügigkeit der Schichten und macht die Ausrichtung zu erleichtern. In diesem Fall ist das Gerät auf ein Stück Gaze gelegt, damit die Methanoldämpfe zu entkommen.
- Cure den ausgerichteten PDMS-Schichten auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 8 h
- Nach dem Verkleben der pneumatischen Membran auf die unterste Schicht, wiederholen Sie die Schritte 3,2 bis 3,4 zur Verbindung der oberen Kanal auf die versammelten Composite PDMS-Gerät.
4. Montage der PDMS-Gerät 3,4
- Die Bohrungen in den Einlass-und Auslasskanäle für die Aussaat eukaryotischen Zellen und Bakterien eingesetzt.
- Connect Tygon-Schlauch (0,01 Zoll OD) zu den Häfen und den Betrieb der pneumatischen Schicht durch Ziehen mit 20ml Spritze.
- Legen Sie die PDMS-Modell und eine vorgereinigte Glasträger in ein Sauerstoff-Plasma-Kammer. Schalten Sie Plasma für 20 sec (Sauerstoffdruck 20 sccm, RF 300W) ohne Anlegen des Vakuums.
- Um den Kontakt zwischen der Insel Wand (PDMS) Bindung an den Glasträger zu verhindern, sofort eine Verbindung mit einer Spritze, um das Gerät und das Vakuum, indem Sie die Spritze und halten es fest.
- Drücken Sie das PDMS-Modell auf das Glas (innerhalb von 2 Minuten).
- Cure die PDMS-Gerät bei 80 ° C für 10 Minuten.
5. Die Behandlung der Glasoberfläche mit Fibronektin
- Sterilisieren Gerät unter UV für 15 Minuten nach dem Anschluss Tygon Schlauch an jedem Port.
- Fill und Flow der sterilisierten PBS in den Kanal, um alle Ablagerungen in den Kanal zu entfernen. Bewerben Flow für 10 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. Die Luftblasen können leicht entweichen die PDMS wegen seiner Gasdurchlässigkeit.
- Füllen Sie ein Farbstoff-Lösung in den Luftkanal, um die Bildung von Luftblasen in den Kanal zu verhindern.
- Zur Erleichterung der eukaryotischen Zelle Aussaat auf dem Glas, die Einführung einer 1 pg / ml-Lösung von Fibronektin in das Gerät und Inkubation für 40 min bei 37 ° C.
- Waschen Sie die überschüssige Fibronektin mit 1 ml Wachstumsmedium.
6. Bildung und Messung von kommensalen E. coli Biofilm inInseln
- Verdünnen Sie die symbiotischer Bakterien (zB E. coli BW25113/pCM18) in M9 Minimalmedium bis OD 600 ~ 1 zur Bildung eines Kommensalen Biofilm in den geschlossenen Kammern / Inseln.
- In der Nähe der Insel Wand durch die Anwendung positiver Flüssigkeitsdruck. Eine hausgemachte air-to-Liquid-Druck-Wandler wird verwendet, um Luft Blasenbildung in den Kanal zu verhindern.
- Einführung der kommensalen E. coli in die Inseln mit dem Ventil geschlossen und verhindert, dass Bakterien für 1 Stunde bei 32 ° C legen
- Waschen Sie die losen Bakterien und perfuse einer verdünnten Bakteriensuspension (OD 600 ~ 0,05) bei 0.25mL/hr für 12 Stunden.
- Spülen Sie den Biofilm mit frischem DMEM Nährmedien zu locker angehefteten Bakterien zu entfernen und die Vorbereitungen für eukaryotischen Zelle Anhang.
- Bild des Biofilms mit einem Leica TCS SP5 konfokale Laser Scanning Mikroskop (Bannockburn, IL) und Visualisierung der Biofilm-Architektur mit dem Imaris Software 5.
7. Seeding eukaryotischen Zellen um bakterielle Inseln 6-8
- Trypsinize HeLa Zellen aus Zellkulturflasche und resuspendieren in DMEM-Medium für eine Aussaatdichte von 5 x 10 5 Zellen / ml.
- Einführung HeLa-Zellen in das Gerät bei einer Flussrate von 2 ml / min mit einem Picoplus Spritzenpumpe (Harvard Apparattus, MA). Stellen Sie sicher, dass die Insel Wand abgesenkt wird, so dass die bakteriellen Biofilm getrennt von den HeLa-Zell-Region ist. Dieser Schritt sollte auf der Bühne eines Lichtmikroskops durchgeführt werden, so dass die Einheitlichkeit der Aussaat bestimmt werden kann.
- Klemmen Sie die Zelle Steckdose, um die Bewegung der Zellsuspension in den Kanal und Inkubation für 6 h bei 37 ° C zu reduzieren in einer 5% CO 2-Inkubator.
- Perfundieren das Gerät mit Wachstumsmedium bei 0,5 ml / h zu losen Zellen zu entfernen.
- Aktualisieren Sie die DMEM Medium für HeLa und kommensalen E. coli alle 6 Stunden.
8. Einführung von pathogenen Bakterien in die Insel und der Exposition gegenüber eukaryotischen Zellen
- Bereiten E. coli O157: H7 (EHEC) auf HeLa-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 100:1 200:1 (Anzahl der EHEC pro HeLa Zellen) zu infizieren.
- Spülen und waschen sich lose befestigt symbiotischer Bakterien.
- Einführung einer verdünnten EHEC Suspension (OD 600 ~ 0,1) in den Inseln.
- Inkubieren Gerät bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator für 6 Stunden ohne Strom zu ermöglichen EHEC auf Signale im kommensalen Biofilm ausgesetzt werden.
- Heben Sie die PDMS Wand zu EHEC in der kommensalen Inseln aussetzen HeLa-Zellen für 6 Stunden.
- Spülen Sie den Kanal mit PBS und Flecken für lebende und tote Zellen unter Verwendung des Live / Dead-Kit (L3224, Invitrogen, CA).
- Bild mehrere Standorte auf einem Zeiss Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop und schätzen die Zahl der lebenden und toten Zellen.
9. Vertreter Ergebnisse 9
Die Abfolge der Ereignisse in GI-Trakt Infektionen wurde durch die Entwicklung einer Monoschicht von HeLa-Zellen und eine kommensalen E. nachgeahmt coli Biofilm und Freilegen EHEC der kommensalen Biofilm vor der Infektion von HeLa-Zellen. Die Schritte bei der Herstellung der mikrofluidischen Co-Kultur-Modell sind in Abbildung 1 dargestellt. 2A zeigt eine 3-dimensionale Darstellung der Co-Kultur-Gerät. Die beiden Regionen in der Co-Kultur-Gerät der eukaryotischen Zellkulturkammer und die bakterielle Insel sind in Abbildung 2B mit verschiedenen Farbstoffen (lila für den eukaryotischen Regionen und grün für die bakterielle Insel) gezeigt. Die Machbarkeit der Isolierung der Bakterienkultur Regionen aus den umliegenden eukaryotischen Region ist in Abbildung 2C mit Farbstoffen dargestellt. Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse von Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien. 3A zeigt Kolonisierung der kommensalen Biofilm (grün) Insel EHEC (rot). 3B zeigt das Nebeneinander von Epithelzellen und kommensalen E. coli mit EHEC in der bakteriellen Insel. Der RFP Ausdruck EHEC und GFP-exprimierenden symbiotischer Bakterien sind in der Insel, wenn die PDMS Wand abgesenkt lokalisiert ist, welche die Machbarkeit der Isolierung der bakteriellen Insel von Epithelzellen.
Abbildung 1: Cell Seeding Schema in der Co-Kultur-Modell. (1) Die PDMS Wand abgesenkt wird, um eine Insel bilden, sind symbiotischer Bakterien in die Insel eingeführt, und Fibronektin ist rund um die Insel geflossen. (2) HeLa-Zellen sind in den Regionen rund um die Insel ausgesät. (3) Nach HeLa Zellen Konfluenz erreicht und die kommensalen Biofilm entwickelt hat, ist EHEC in der Insel eingeführt. (4) Die PDMS Wand abgehobenbis zu entlarven HeLa-Zellen rund um die Insel zu EHEC. Inset zeigt Details des Ventils.
Abbildung 2: Microfluidic Modell für Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien. (A) Dreidimensionale Wiedergabe der Co-Kultur-Gerät zeigt pneumatisch betätigte Trapping Regionen zur Bildung bakterieller Inseln unter Epithelzellen. Jede bakterielle Insel (1200 Mikrometer Durchmesser und 1000 um auseinander) hat einen separaten Eingang und Ausgang für die Bereitstellung von Nährmedien und Beseitigung von Abfällen von der Insel. (B) Mikroskopische Aufnahme der Co-Kultur-Gerät mit Farbstoffen, welche die verschiedenen Regionen (epithelialen Zell-Zone, bakterielle Inseln). (C) Die Treue der pneumatischen Trapping-System ist durch eine Senkung der PDMS Wand (links) mit einem pneumatisch aktivierten Kanal (blau), die Einführung Purpur in die geschlossene Insel Inseln und fließenden gelben Farbstoff um es für 48 Stunden gezeigt Wenn die PDMS Wand (rechts) ausgelöst wird, wird die Inselregion in die umliegenden gelben Farbstoff ausgesetzt. Scale-Balken repräsentiert 500 um.
Abbildung 3: Co-Kultur von HeLa-Zellen und Bakterien. (A) Fluoreszenzbild RFP-exprimierenden EHEC und GFP-exprimierenden E. coli BW25113 in Insel. (B) Überlagerung der gesendeten, grünen und roten Fluoreszenz-Bildern in das Gerät. Scale-Balken repräsentiert 200 um.
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Discussion
Konventionelle Tests für Erreger Befestigung und Besiedlung nutzen eine Monoschicht von eukaryotischen Zellen in Zellkulturplatten, in die Krankheitserreger aufgenommen. Diese Modelle sind nicht physiologisch relevant, da sie nicht integrieren Kommensale bakteriellen Biofilm auf eukaryotischen Zellen entwickelt. Einfache Zugabe eines pre-grown Bakterienkultur zu eukaryotischen Zellen ist unwahrscheinlich, dass diese Konformation führen, wie Biofilmen äußerst Strukturen, die im Laufe der Zeit entwickeln organisiert sind, und es ist äußerst schwierig, wenn nicht fast unmöglich, zu Kultur eukaryotischen Zellen in Anwesenheit von Bakterien für längere Zeit ohne nennenswerten Verlust der Lebensfähigkeit. Da Krankheitserreger nicht durch eine kommensalen Biofilm in dieser Modelle navigieren zu tun, um an Epithelzellen, machen Sie sich diese Modelle nicht genau imitieren die Organisation von Epithelzellen und symbiotischer Bakterien im Magen-Darm-Trakt. Hier stellen wir die Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung, die pneumatisch gesteuerte Trapping verwendet für Co-Kultur von eukaryotischen Zellen und Bakterien. Mit HeLa-Zellen als Modell eukaryontische Zelllinie und EHEC als Modell Erreger zeigen wir, dass die Co-Kultur-Gerät kann die Insel Region zu halten isoliert sowie die Unterstützung der Pflege und Entwicklung einer HeLa Zellmonolayer und Kommensale E. coli Biofilm. Die mikrofluidischen Co-Kultur-Modell ermöglicht nicht nur die Lokalisierung von symbiotischer Bakterien und Epithelzellen, sondern auch vor-aussetzt Krankheitserreger zu symbiotischer Bakterien vor begegnen Epithelzellen; damit, präsentiert eine physiologisch relevante Umfeld während der Kolonisation. Darüber hinaus kann der Co-Kultur-Modell ein nützliches Werkzeug für grundlegende Studien über die Rolle von spezifischen Signalen auf EHEC Infektiosität sowie für Anwendungen wie Screening potenzieller probiotischen Stämme konzentriert.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation (CBET 0846453) und die National Institutes of Health (1R01GM089999) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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