Summary
Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.
Abstract
Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: kabloları, lümen oluşumu, anastomoz, yeni bir bazal membran oluşumu ve ekstrasellüler matriks, AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Burada bir insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tahlil optimize göstermektedir. Bu modeli özetlediği önemlisi anjiyogenez en önemli erken aşamalarında, ve gemilerin, polarize EC çevrili patent hücrelerarası lümen gösterir. Gemiler, faz kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu ile kolayca gözlenen ve downstream uygulamalar için saf formu ele olabilir.
Protocol
Prosedür
- Aşırı kan kapalı temiz yastık ve dab kablosu yatırın. Kablosunun her iki ucunda da taze kesim olun.
- Damar içine iğne ON plastik kılıflı 21 1 / 2 G iğne takın. (Ven en büyük açılış; 2 küçük olanları arterler)
- Kelepçe bir hemostatla yerde iğne Hanks, 20cc şırınga ve iğne takın.
- Orta basınç ile damar yoluyla Hanks itin. Beher çamaşır suyu ile atık toplayın. (Itme ven haşhaş iğne önleyecek tek elle iğne ve kordon Holding), damar içinde kan bir sürü varsa, ikinci bir kez yıkayın.
- Pad üzerinde kablosunu Lay ve ven diğer ucunu kelepçe. Hanks kordon boyunca sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için birkaç mL ile doldurun. 5 ml çekiniz ve alt kelepçe kesmek.
- 20cc şırınga çıkarın. 10cc şırınga pistonu çıkarın. 10ml kollajenaz dökmek ve piston yerine 10cc şırınga, iğne takın. Ilk miktarda açık ucunu çıkmak görene kadar, damar içine kollajenaz doğru itin. Açık ucunu yeniden kelepçe ve ven orta distansiyon kalmayıncaya kadar kollajenaz ile doldurun. Çok fazla düz kas kirlenme distansiyon sonuçlanır.
- Kordon hafifçe masaj yapın.
- 15 dakika için 37 DPBS kuluçkaya kablosu (bağlı hemostat, iğne ve şırınga ile) ° C.
- Kuluçka iken, 2. kordon adımları 1-8 devam ediyor.
- Inkübasyondan sonra, beher kablosu dışarı almak ve 50ml tüp üzerindeki kabloyu tutarken, alt kelepçe yukarıda ucu tüp içinde her şeyi toplamak için emin olun. Kablosu aracılığıyla kalan kollajenaz itin, sonra 20cc şırınga takın ve orta basınç yoluyla Hanks itin.
- Herhangi bir düz kas hücreleri gerekmesi durumunda, şu anda kabloyu atın. Aksi takdirde, 37 ~ 5ml kollajenaz ve inkübe ikinci bir tüp içine 50 ml aynı kablosu ° C 30-60 dk.
- Tüm kabloları yapılır kadar tüp tutun.
- Tüpler 5 dakika için ~ 1200 rpm hızında dönerler.
- Aspire süpernatant (yaklaşık 1-2 ml için hariç) bir T25 5mls PHEC pelet + ve plaka tekrar
- Bir gecede 37 ° C ile% 5 CO 2 inkübe edin.
- Ertesi gün süpernatantı kaldırmak ve taze medya ile değiştirin. Birçok eritrosit varsa, M199 ile PHEC + eklemek, sonra bir kez yıkayın. (1-4 gün) plaka konfluent kadar olağan olarak kuluçka devam edin. Jelatinize T75 böler.
- Bir kez T75 üç T75s bölünür, konfluent. Başına iki şişe şişesi dondurun.
Not: Endotel hücreleri (etkisizleştirilir) bir arnavut kaldırımlı bir görünüme sahip. Endotel hücreleri, bazen bir çift genellikle bir unactive devlet haline geri geçtikten sonra, sağ izolasyon sonra (uzun ve sivri) aktive edilir .
Temizleme
- Çok dikkatli bir şekilde, kavuz konteyner iğneler atmayın.
- Büyük biohazard konteyner şırınga atın.
- Tüm doku, küçük bir biohazard torba içine koyun. -20 Yakın çanta ve dondurma ° yakma kadar.
- Virüsit tüm araçların en az 10 dakika bekletin.
- / Ağartıcı beher atık inkübasyon medya ekleyin. En az 10 dakika bekletin.
- Tezgah pedleri biyolojik tehlikeli atık içine atın.
- Bardak, masa üstü ve su banyosu vircide kapağı iç ve dış aşağı püskürtün. 10 dakika bekletin, sonra silin.
- Ilık su ile durulayın ve beher ve araçları (Pas kalmaz araçların kapalı blot) kuruması için raf asmak.
- Dekontamine atık lavabonun aşağı atın.
- Kullanılmayan ortamları buzdolabı dönün.
- Biyolojik tehlikeli atık eldiven atın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Collagenase | 10 mL per cord, warmed to 37 °C | ||
| Tissue culture flasks | T75, one per cord. | ||
| Hanks medium | |||
| scissors | sterile | ||
| beaker | sterile | ||
| 50 mL tubes |
