Оценка Двумерные Кристаллизация Испытания малых мембранных белков для структурных исследований биологии электронным кристаллографии
Summary
Оценка двумерных (2D) испытания кристаллизации для формирования упорядоченных массивов мембранный белок является очень важные и трудные задачи в электронной кристаллографии. Здесь мы описываем наш подход в скрининге и идентификации 2D-кристаллы преимущественно небольшие мембранные белки в диапазоне 15 – 90kDa.
Abstract
Электронная кристаллография развивалась как метод, который может быть использован либо альтернативно или в сочетании с трехмерной кристаллизации и рентгеновской кристаллографии для изучения структурно-функциональных вопросов мембранных белков, а также растворимые белки. Скрининг для двумерных (2D) кристаллов методом просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ) является важным шагом в поиске, оптимизации и отбора проб для высокого разрешения сбора данных крио-ЭМ. Здесь мы опишем основные шаги по выявлению как крупные, так и приказал, а также небольшой 2D массивы, которые потенциально могут поставлять критически важную информацию для оптимизации условий кристаллизации.
Работая с различными увеличениями на EM, данные по целому ряду критических параметров получается. Нижняя увеличении поставок ценные данные о морфологии и размера мембраны. При более высоких увеличениях, возможно кристалла порядка и 2D размеры определяются. В этом контексте он описал, как ПЗС-камеры и интернет-преобразования Фурье используются при более высоких увеличениях оценить proteoliposomes к порядку и размеру.
Хотя 2D-кристаллы мембранных белков чаще всего выросли на восстановление диализом, скрининг технику в равной степени применима для кристаллов производится с помощью монослоя, родной 2D-кристаллы, и упорядоченных массивов растворимых белков. Кроме того, методы, описанные здесь, применимы к скрининга для 2D-кристаллы из еще более мелких, а также крупные белки мембраны, где меньше белков требуется такое же количество помощи в идентификации, как наши примеры и решетки больше белков может быть более легко идентифицировать на более ранних стадиях отбора.
Protocol
Discussion
Правильная оценка образцов требует тщательной оценки достаточное количество мембран. Например, образцы с всего 2% кристаллического массива из более чем 180 отображаемого proteoliposomes дало важную информацию для быстрой оптимизации 2D условий кристаллизации 7.
При осажде…
Acknowledgements
Мы благодарны нашим сотрудникам за предоставление ценных образцов белков, которые способствовали некоторые наши методы, касающиеся опыта и наблюдений. Гюнтер Schmalzing любезно предоставил возможность FR присоединиться к этому проекту. Барбара Армбрустер, Иаков Бринк и Дерик мельницы поблагодарил за их выдающуюся помощь и вход на оборудование. Финансирование было предоставлено грантов NIH HL090630.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
