Bedöma Tvådimensionella Kristallisering Trials of Small Membrane proteiner för strukturbiologi studier av elektron Kristallografi
Summary
Utvärdering av tvådimensionella (2D) kristallisering prövningar för bildandet av beställda arrayer membranprotein är en mycket viktig och svår uppgift i elektron kristallografi. Här beskriver vi vår strategi i screening för och identifiera 2D kristaller i framför allt små membranproteiner i intervallet 15 – 90kDa.
Abstract
Electron kristallografi har utvecklats som en metod som kan användas antingen alternativt eller i kombination med tredimensionella kristallisation och röntgenkristallografi för att studera struktur och funktion frågor om membranproteiner, samt lösliga proteiner. Screening för tvådimensionella (2D) kristaller av transmissionselektronmikroskop (EM) är den kritiska steget i att hitta, optimering och välja ut provexemplar för hög upplösning datainsamling av Cryo-EM. Här beskriver vi de grundläggande stegen i att identifiera såväl stora som beställts, samt små 2D-arrayer, som potentiellt kan leverera kritisk information för optimering av kristallisering villkor.
Genom att arbeta med olika förstoring på EM, är uppgifter om ett antal kritiska parametrar erhållits. Lägre förstoring levererar värdefulla data på morfologi och membran storlek. Vid högre förstoring är möjliga för-och 2D kristall dimensioner bestäms. I detta sammanhang är det beskrivs hur CCD-kameror och online-Fouriertransformer används vid högre förstoringar att bedöma proteoliposomes för beställning och storlek.
Även om 2D-kristaller av membranproteiner är oftast vuxit med beredning av dialys, är screening tekniken lika tillämpliga för kristaller som produceras med hjälp av monolager, infödda 2D-kristaller, och beställde arrayer av lösliga proteiner. Dessutom, de metoder som beskrivs här gäller för screening för 2D-kristaller av ännu mindre såväl som större membranproteiner, där mindre proteiner kräver samma mängd vård i identifiering våra exempel och galler av större proteiner kan vara lättare att identifiera i tidigare skeden av screening.
Protocol
Discussion
Ordentlig utvärdering av prov kräver en noggrann bedömning av ett tillräckligt antal av membran. Till exempel gav prover med så låg som 2% kristallin matriser av över 180 avbildas proteoliposomes kritisk information för snabb optimering av 2D kristallisering villkor 7.
När utfällning av proteinet sker, kan ett rutnät läggas ned från ytterligare screening efter inspektion vid låg förstoring, även om enstaka delar utfällning av protein sker. Även mycket små membra…
Acknowledgements
Vi tackar våra samarbetspartners för att ge värdefullt protein prover, vilket bidrog till några av våra metoder relaterade erfarenhet och observationer. Günther Schmalzing förutsatt vänligt möjlighet till FR att gå med detta projekt. Barbara Armbruster, Jacob Brink och Deryck Mills är tack för deras enastående hjälp och synpunkter på utrustning. Finansieringen kom från NIH bidrag HL090630.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
