Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography
Summary
Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine im Bereich von 15 – 90kDa.
Abstract
Electron Kristallographie als eine Methode, die entweder alternativ oder in Kombination mit dreidimensionalen Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse zu Struktur-Funktions-Anfragen von Membranproteinen sowie lösliche Proteine Studie verwendet werden entwickelt. Screening für die zweidimensionale (2D) Kristalle mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) ist der kritische Schritt bei der Suche, Optimierung und Auswahl Proben für hochauflösende Datenerfassung durch Kryo-EM. Hier beschreiben wir die grundlegenden Schritte bei der Identifizierung von großen und bestellt, als auch kleine 2D-Arrays, die potenziell liefern können wichtige Informationen zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen.
Durch die Zusammenarbeit mit unterschiedlichen Vergrößerungen an der EM werden die Daten über eine Reihe von kritischen Parametern erhalten. Lower Vergrößerung liefert wertvolle Daten über die Morphologie und Membran Größe. Bei höheren Vergrößerungen sind möglich, um-und 2D-Kristall Dimensionen ermittelt. In diesem Zusammenhang wird beschrieben, wie CCD-Kameras und Online-Fourier-Transformationen bei höheren Vergrößerungen werden verwendet, um Proteoliposomen für Ordnung und Größe zu beurteilen.
Während 2D-Kristalle von Membranproteinen am häufigsten durch Rekonstitution durch Dialyse gewachsen sind, ist die Screening-Technik gleichermaßen für Kristalle mit Hilfe von Monoschichten, native 2D-Kristalle hergestellt und Anordnungen von löslichen Proteinen. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Methoden für das Screening für 2D-Kristalle von noch kleineren als auch größeren Membranproteine, wo kleinere Proteine erfordern die gleiche Sorgfalt bei der Identifikation wie unsere Beispiele und das Gitter von größeren Proteinen könnte besser erkennbar sein in früheren Stadien des Screenings.
Protocol
Discussion
Proper Auswertung von Proben erfordert eine sorgfältige Beurteilung einer ausreichenden Anzahl von Membranen. Zum Beispiel gab Proben mit so niedrig wie 2% kristallinen Arrays aus über 180 abgebildet Proteoliposomen wichtige Informationen für die schnelle Optimierung von 2D-Kristallisation Bedingungen 7.
Wenn Fällung des Proteins auftritt, könnte ein Gitter von der weiteren Screening nach der Inspektion bei geringer Vergrößerung aufgegeben werden, obwohl gelegentliche parti…
Acknowledgements
Wir danken unseren Mitarbeitern für die wertvolle Protein-Proben, die einige unserer Methoden bezogenen Erfahrungen und Beobachtungen beigetragen. Günther Schmalzing freundlicherweise die Möglichkeit, FR, dieses Projekt beizutreten. Barbara Armbruster, Jacob Brink und Deryck Mills sind bekannt für ihre hervorragende Hilfe und Eingang am Gerät dankte. Die Finanzierung wurde von NIH HL090630 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
