Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi
Summary
Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa – Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.
Abstract
Elektron kristalografisi, ya alternatif olarak veya membran proteinlerinin yapı-işlev sorular, eriyen proteinlerin yanı sıra çalışma, üç boyutlu kristalizasyon ve X-ışını kristalografisi birlikte kullanılabilecek bir yöntem olarak gelişti. Transmisyon elektron mikroskobu ile iki boyutlu (2D) kristalleri için tarama (EM) optimize ve cryo-EM tarafından yüksek çözünürlüklü veri toplama için örnekler seçerek bulma kritik bir adımdır. Burada potansiyel kristalizasyon koşullarının optimizasyonu için kritik bilgi kaynağı olabilir, büyük ve sipariş yanı sıra küçük 2D dizileri belirlenmesinde temel adımları açıklar.
EM farklı büyütme ile çalışarak, bir dizi kritik parametreleri veri elde edilir. Alt büyütme, morfolojisi ve membran boyutu değerli veri sağlamaktadır. Yüksek büyütmeler, düzen ve 2D kristal boyutları belirlenir. Bu bağlamda, yüksek büyütmelerde kullanılan CCD kamera ve online-Fourier Dönüşümleri düzen ve boyutu için proteoliposomes değerlendirmek için nasıl tarif edilir.
Membran proteinlerinin 2D kristalleri diyaliz ile sulandırıldıktan en yaygın olarak yetiştirilen, tarama tekniği, mono tabakaları, yerli 2D kristaller yardımıyla üretilen kristal için de geçerlidir ve çözünür proteinler dizileri emretti. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntemleri büyük proteinler ve bizim örnek ve kafes gibi küçük proteinlerin belirlenmesinde aynı miktarda bakım gerektiren daha küçük 2D kristalleri gibi büyük membran proteinleri, tarama daha kolay tanımlanabilir olabilir tarama önceki aşamada.
Protocol
Discussion
Uygun değerlendirme örneklerinin membran yeterli sayıda dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Örneğin, 180 üzerinden görüntülü proteoliposomes düşük% 2 olarak kristal dizileri örnekleri 2D kristalizasyon koşullarına hızlı optimizasyon 7 için kritik bilgi verdi.
Zaman zaman kısmi protein yağış görülse de, bir ızgara protein yağış oluştuğunda, düşük büyütmede incelemeden sonra, daha fazla tarama terk olabilir. Olsa bile çok az 100 nm küçük m…
Acknowledgements
Biz bazı yöntemleri ile ilgili deneyim ve gözlemler katkıda bulunan değerli protein örnekleri, sağlamak için bizimle işbirliği yapanlara teşekkür ediyorum. Günther Schmalzing lütfen bu projeye katılmaya FR için fırsat sağladı. Barbara Armbruster, Jacob Brink ve Deryck Mills olağanüstü yardım ve ekipman giriş için teşekkür. Finansman NIH hibe HL090630 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
