Summary
Den electroolfactogram (EOG) inspelning är en informativ, lätt att genomföra, och tillförlitligt sätt att bedöma lukt-funktion på samma nivå som luktepitel. Detta protokoll beskriver en inspelning setup, mus vävnad förberedelse, datainsamling, och grundläggande analys av data.
Abstract
Djur är beroende av luktsinne för många kritiska beteenden, som att hitta mat källor, undvika rovdjur, och att identifiera artfränder för parning och andra sociala interaktioner. Den electroolfactogram (EOG) inspelning är en informativ, lätt att genomföra, och tillförlitlig metod att analysera lukt funktion på nivå luktepitel. Sedan 1956 beskrivningen av EOG av Ottoson hos grodor 1 har EOG inspelning tillämpats i många ryggradsdjur, inklusive salamandrar, kaniner, råttor, möss och människor (granskats av Scott och Scott-Johnson, 2002, ref. 2). De senaste framstegen inom genetisk modifiering på möss har återuppväckt intresset för att spela in EOG för fysiologisk karakterisering av luktsinnet fungerar i knock-out och knock-i möss. EOG inspelningar har tillämpats med framgång för att påvisa den centrala roll som luktsinnet komponenter signaltransduktion 3-8, och på senare tid för att karakterisera bidrag vissa regulatoriska mekanismer för att OSN svar 9-12.
Luktämnen detektion sker vid ytan av luktepitel på flimmerhåren i OSN, där en signaltransduktion kaskad leder till öppning av jonkanaler, genererar en ström som rinner ut i flimmerhåren och depolarizes membranet 13. Det EOG är den negativa potentiella inspelade extracellularly på ytan av luktepitel på luktämnen stimulans, till följd av en summering av eventuella förändringar som orsakas av enskilda lyhörd OSN i inspelningen område 2. Jämförelse av amplitud och kinetik för EOG ger därigenom värdefull information om hur genetisk modifiering och andra experimentella manipulationer påverka molekylär signalering som ligger bakom OSN svar på lukt.
Här beskriver vi en luft-fas EOG inspelning på en beredning av mus lukt näsmusslan. Kortfattat, efter offra musen, är luktsinnet näsmusslan exponeras av Halvera huvudet längs mittlinjen och ta bort membranet. Den turbinata preparatet placeras sedan i inspelningen setup, och en inspelning elektrod placeras på ytan av luktepitel på en av de mediala näsmusslan. En referens elektrod är elektriskt ansluten till vävnaden genom en buffertlösning. En kontinuerlig ström av fuktad luft blåses över ytan av epitelet att hålla den fuktig. Den ånga av luktämnen lösningar är uppblåst i strömmen av fuktad luft för att stimulera epitelet. Svaren registreras och digitaliseras för vidare analys.
Protocol
Del 1. Den EOG inspelning inställning
Inspelningen Utrustningen består av en inspelning elektrod, som referens, lufttillförsel rör, prov scen och dissekera mikroskop, allt förankrade på en luft-tabell i en Faradays bur. Micromanipulators används för placering av elektroderna och luften leverans röret. En kontinuerlig luftström är bubblas genom vatten för att lägga fukt innan de passerar genom luften leverans röret och över provet. En 60 mm kultur fat fyllt med Sylgard till ett djup av 6-8 mm används som monteringsyta för provet. En bra och en kanal som är urholkad av Sylgard i montering skålen för att ge ett sätt att elektriskt ansluta referenselektrod med den förlaga via ändrade Ringers lösning.
Inspelningen elektroden och referenselektrod är anslutna till en förstärkare. Signaler från förstärkaren skickas till en digitizer och sedan till en dator. Program som Axograph eller pClamp kan användas för att styra stimulans protokollet, att spela in signalen och för senare analys av svaren. Ett oscilloskop ansluts efter förstärkaren kan vara bekvämt för realtidsövervakning av den elektriska potential samtidigt placera in elektroden och under EOG inspelningar.
Leverans av luktämnen stimuli styrs av en Picospritzer, som är ansluten till samma dator som används för signal förvärvet. Lufttrycket vid Picospritzer är satt till 10 psi. En enda luft tank och regulator kan användas för tilluft till både luft bordet och Picospritzer. En andra luft tank och regulator används för att ge luft för fuktad luftströmmen, eftersom detta kräver ett lägre tryck och en stor mängd luftflöde. Strax innan ett luktämnen stimulans är Picospritzer utgången är ansluten till en luktämnen flaska. Den luktämnen flaskan kopplas sedan till luft leverans röret.
Del 2: Förbered elektroder
Inspelningen elektroden är en chlorided silvertråd i en drog glas kapillär fylld med modifierad Ringers lösning (135 mM NaCl, 5 mm KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 10 mm HEPES, pH 7,4, filtrera steriliserad). Hänvisningen elektroden är en chlorided silvertråd.
- Installera silvertråd i elektrodhållare. För inspelning elektrod bör man till två centimeter av tråd sticka ut från slutet av elektrodhållare. Mer tråd kan lämnas för referens elektrod.
- För att lägga till AgCl pälsen till silvertråd, placera tråd i 0,1 M NaCl och ansluta elektroden innehavaren till den positiva terminalen på en 1,5-9 V DC strömkälla. Den negativa terminalen på strömkällan bör vara elektriskt ansluten till 0,1 M NaCl-lösning. Låt chloriding reaktionen fortsätta i 10 minuter. För att utjämna eventuell statisk laddning mellan bokföringen och den som referens, kort beröra elektroderna tillsammans innan du installerar dem på inspelningen apparaten.
- Dra ett glas kapillär med hjälp av en mikropipett avdragare. Öppningen i toppen av kapillära bör vara cirka 50-10 mikrometer i diameter.
- Använd en diamant penna gör mål och bryta den trubbiga änden av kapillär så det är ~ 2 cm längre än silvertråd. Fire-polish den kapade ändan med butan facklan.
- Smält 0,5% agaros i modifierad Ringers lösning. Dra en liten mängd smält agaroslösningen i spetsen av elektroden med hjälp av en pipett.
- Fyll drog kapillära ca 1 / 2 av vägen med ändrade Ringers lösning (en spruta som har varit uppvärmd och drog för att ha en lång smal utgång är användbar för detta ändamål). Knacka försiktigt på kapillär att få bort eventuella luftbubblor. Förvara fyllde elektroden i lager burk med en liten mängd av modifierade Ringers lösning i botten tills de är redo att användas. När ett vävnadsprov är beredd och redo för inspelning, installera ett kapillärrör under inspelningen elektrod tråd.
Del 3: Förbereda luktämnen lösningar
Den odörer amylacetat och heptaldehyde framkalla stora insatser och är därför bra val som EOG stimulantia.
- I mikrocentrifugrör, förbereda en serie spädningar av luktämnen i dimetylsulfoxid (DMSO). Som en utgångspunkt för en dos-respons-kurva, förbereda 10-faldig utspädningar från 5 Mkr till 5 x 10 -6 M. Gör färska spädningar varje dag.
- Ytterligare späda på luktämnen 50-faldig i vatten genom att blanda 100 mikroliter utspädd lager i DMSO med 4,9 mls vatten i 2 ounce flaskor med silikon proppar. Låt lösningar jämvikt i flaskorna i minst 30 minuter. Observera att koncentrationen av doftämnen i varje flaska är okänd, men kommer att variera som en funktion av koncentrationen av doftämnen i den flytande fasen.
- Sätt i två 18-gauge nålar genom kisel proppen till provide in-och utgångar. Hamnarna ska anslutas när flaskan inte används.
Del 4: Inspelning av EOG och analysera data
- Offra en mus av CO 2 dödshjälp eller bedövningsmedel överdos följt av halshuggning. Ta bort skinnet överliggande skallen och sagittally HALVERA huvudet längs mittlinjen.
- Montera ena halvan av huvudet, mediala sidan uppåt, på montering skålen. Ta försiktigt bort membranet att exponera näsmusslan.
- Placera skålen med monterad vävnad på inspelningen scenen. Passa på scenen så att inspelningen plats på näsmusslan är centrerad under mikroskop.
- Slå på luften tanken att leverera fuktad luft till turbinata ytan. Placera luften leverans röret så att den är ca 10 mm från inspelningen plats. Flödet är ~ 600 ml / min.
- Ställ in förstärkaren till DC-läge (AC förstärkning kommer att framkalla artefakter i EOG signal) med lågpassfilter vid 1 kHz, och få på 100X.
- Mount inspelning och elektroder hänvisning när micromanipulators.
- Sänk referenselektrod i brunnen på montering skålen och täck med modifierad Ringers lösning så att den är elektriskt ansluten till vävnaden.
- Sänk försiktigt ned inspelningen elektroden på ytan av turbinata IIb eller III. Elektroden ska knappt vidröra ytan på luktepitel! När elektroden kommer i kontakt med epitel (dvs fyller en elektrisk krets) en rät baslinje visas i oscilloskopet.
- Fäst en luktämnen flaska åt sidan porten på lufttillförsel röret.
- På datorn, starta en stimulering protokoll. Den samplingsfrekvens för datainsamling ska vara 2 kHz eller högre. Programvaran kommer att utlösa en lukt puls och börja spela in.
- En typisk stimulering protokoll kan vara ett 100-ms varaktighet enda puls, parade 100-ms pulser åtskilda av ett 1-sek intervall, eller en 10-sek ihållande puls.
- Låt någon gång mellan protokoll så vävnaden minimalt är anpassad. En minut räcker för flytande koncentrationer av amylacetat och heptaldehyde upp till 10 -3 M, i högre koncentrationer ge 5 minuter. Efter att leverera hög lukt koncentrationer (som vid slutet av en dos-respons kurva) kvarvarande lukt kan finnas kvar i röret. Tvätta luftslangen med 95% etanol och torka innan du fortsätter med ytterligare vävnadsprover.
- Axograph mjukvara erbjuder verktyg för att mäta viktiga parametrar för EOG-signalen. Sådana parametrar inkluderar svaret amplitud, latens, tiden till peak och konstanter tidpunkten för uppsägningen. Det kan vara önskvärt att digitalt filtrera spår vid 25 Hz innan ytterligare analys.
Representativa resultat
Figur 1. Parametrar för EOG analys. Flertal parametrar EOG är särskilt användbara för jämförelse av svaren mellan möss, inklusive som svar amplitud, latensen (tiden mellan när den stimulans administreras och svaret börjar), stigtid (tiden mellan start av svaret och toppen) tiden till maximal (tiden från början av den stimulans till toppen av svaret) och tidskonstanten för uppsägning (τ, bestäms genom att montera den avtagande fasen av svaret på en enda exponentiell ekvation ). För jämförelse av kinetiska parametrar som latens, stigtid och tidskonstant för uppsägning, är det lämpligt att normalisera topp amplitud av svaren före analys.
Figur 2. Representant EOG signaler under olika stimulering protokoll. (A) Exempel på EOGs från en mus som svar på stimulering med ökande koncentrationer av amylacetat. Den svarta linjen längst upp på panelen anger tidpunkt och varaktighet för luktämnen stimulering. Halterna i förklaringen är koncentrationerna av vätskan lösningen. (B) En dos-respons-förhållande genomsnitt från fem möss. Felstaplar är 95% konfidensintervall. En nedgång i maximal amplitud är ofta observeras vid mycket höga lukt koncentrationer. (C) Ett exempel på ett EOG som svar på en ihopparad-puls stimulans. En enda kort puls av luktämnen framkallar anpassning som varar i flera sekunder. (D) Ett exempel på ett EOG som svar på en 10-sek ihållande luktämnen stimulering. Den EOG visar hyposensibilisering under kontinuerlig luktämnen presentation.
Discussion
Med installationen som beskrivs i detta protokoll kommer luktämnen stimuli på ytan av luktepitel vara konsekvent mellan vävnad förberedelser som möjliggör jämförelser mellan vildtyp och muterade möss, även om den exakta luktämnen koncentration och dynamik är okända. Flera faktorer, särskilt inspelningen plats och flödet av fuktad luft, orsaka variationer i EOG. Försiktighet bör vidtas för att spela in från liknande positioner på samma turbinata att minimera variation. Detta kan lätt uppnås genom att konsekvent inspelning från samma sida av huvudet och hålla fotavtryck av mikroskopet, lukt leverans rör och micromanipulators på luft bordet oförändrad mellan vävnadsprover. Dessutom bör vävnadsprover omedelbart placeras i fuktad luft strömma efter dissektion för att förhindra överdriven torkning av vävnad.
EOG inspelningar på möss kan också utföras med en vätska perfusion apparaten på beredd musen näsmusslan 7, 14, 15 eller genom att lämna huvudet intakt och sätta in elektroden i ett litet hål borras ovanför näsmusslan 16, 17. Varje variation av EOG inspelningen har sina egna styrkor: luft-fas inspelningar på vävnad förberedelser som beskrivs i detta protokoll kräver en minimal mängd av installation och är lättast att genomföra, inspelningar med en flytande perfusion apparat underlätta användningen av farmakologiska reagenser, även om hydrofoba karaktären hos många doftämnen komplicerar lukt leverans, slutligen, kan inspelningar där huvudet är kvar intakt användas i "konstgjorda sniffa" experiment, även om elektrodplacering är svårare än när näsmusslan är fullt exponerad.
Disclosures
Möss har hanterats och avlivas med metoder som godkänts av Animal Care och kommittéer Användning av Johns Hopkins University.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Yijun Song, och medlemmar av den Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab vid Institutionen för biologi, Johns Hopkins University för att få råd och hjälp. Med stöd av NIH bidrag DC007395 och DC009946.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. Regional distribution of rat electroolfactogram. J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
