Summary
electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.
Abstract
동물은 음식 소스를 찾을 수 천적을 피하고, 짝짓기 및 기타 사회적 상호 작용에 대한 conspecifics을 식별하는 많은 중요한 행동에 대한 후각에 따라 달라집니다. electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 분석 후각 기능, 정보를 수행하기 쉽고, 안정 방법입니다. 개구리 1 오토슨하여 EOG의 1956 설명 이후, EOG 녹음은 도롱뇽, 토끼, 쥐, 마우스, 그리고 인간 (스캇과 스콧 - 존슨, 2002, 심판 2. 검토) 등 많은 척추 동물에 적용되었습니다. 생쥐에 유전자 조작의 최근 발전 노크 아웃의 후각 기능의 생리적 특성에 대한 EOG 녹음에 관심을 rekindled 및 마우스 기능을 노크합니다. EOG 녹음이 성공적으로 후각 신호 전달 구성 요소 3-8의 중심 역할을 설명하고, 최근에는 9-12 OSN 응답 특정 규제 메커니즘의 기여를 특성화하기 위해 적용되었습니다.
Odorant 감지가 속눈썹에 흐름과 멤브레인 13 depolarizes 전류를 발생, 신호 전달의 캐스케이드는 이온 채널 개방에 이르게 OSNs의 속눈썹에있는 후각 상피의 표면에서 발생합니다. EOG 녹음이 분야 2 개인 반응 OSNs로 인한 잠재적인 변화의 변론으로 인한, odorant의 자극에 따라 후각 상피의 표면에 extracellularly 기록 부정적인 가능성이다. EOG의 진폭과 반응 속도론의 비교함으로써 유전자 변형 및 기타 실험 조작은 냄새에 OSN 응답을 기본 분자 신호에 영향을 미치는 방법에 대한 유용한 정보를 제공합니다.
여기 마우스 후각 turbinates의 준비에 공기 위상 EOG 녹음을 설명합니다. 간단히 마우스를 희생 후 후각 turbinates은 정중선을 따라 머리를 bisecting 그리고 심장을 제거하여 노출됩니다. turbinate 준비는 다음 녹음 설정에 배치하고, 기록 전극은 중간 turbinates 중 하나에있는 후각 상피의 표면에 배치됩니다. 참조 전극은 전기 버퍼 솔루션을 통해 조직에 연결되어 있습니다. humidified 공기의 지속적인 흐름은 그것이 촉촉한 유지하는 상피의 표면을 통해 날려입니다. odorant 솔루션의 수증기는 상피를 자극하는 humidified 공기의 흐름에 부풀 수 있습니다. 응답 기록하고 자세한 분석을 위해 디지털됩니다.
Protocol
1 부. EOG 녹음 설정
레코딩 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 공급 튜브, 표본의 무대, 그리고 해부 현미경, 모든 패러데이 케이지 내에서 공기 테이블에 정박로 구성되어 있습니다. Micromanipulators는 전극의 배치 및 공기 공급 튜브에 사용됩니다. 지속적인 공기 흐름은 공기 배달 튜브를 통하여 및 표본을 통해 전달하기 전에 습도를 추가하는 증류수로 부풀어 오른 모양이다. 6-8밀리미터의 깊이 Sylgard 가득 60mm 문화 요리는 표본에 대한 마운트 표면으로 사용됩니다. 잘하고 채널은 전기적 수정 링어의 솔루션을 통해 표본에 대한 참조 전극을 연결하는 수단을 제공하기 위해 장착 접시에 Sylgard 밖으로 빈입니다.
기록 전극과 참조 전극은 앰프에 연결됩니다. 앰프의 신호는 컴퓨터에 다음 디지타이저로 전송하고 있습니다. 이러한 Axograph 또는 pClamp 같은 소프트웨어는 신호를 기록하고, 응답의 후속 분석을, 자극 프로토콜을 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 앰프 뒤에 연결된 오실로 스코프 기록 전극을 배치하면서 전기 잠재력을 실시간 모니터링과 EOG 녹음하는 동안 편리하게하실 수 있습니다.
odorant의 자극의 전달은 신호 수집에 사용되는 같은 컴퓨터에 연결된 Picospritzer에 의해 제어됩니다. Picospritzer에있는 공기 압력은 10 PSI로 설정됩니다. 하나의 공기 탱크와 레귤레이터는 공기 테이블과 Picospritzer 모두에 공기를 공급하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 공기 탱크와 레귤레이터는이 낮은 압력과 공기의 큰 금액을 필요로 humidified 공기 흐름을 위해 공기를 제공하는 데 사용됩니다. 직전 odorant의 자극을 제공하기 위해 Picospritzer 출력은 odorant 병에 연결됩니다. odorant 병은 다음 공기 공급 튜브에 연결되어 있습니다.
2 부 : 준비 전극
기록 전극은 모세가 수정 링어의 솔루션 (135 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM CaCl 2, 1.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, 필터는 살균 산도 7.4)로 가득 가져온 유리에 chlorided 실버 와이어입니다. 참조 전극은 chlorided 은색 와이어입니다.
- 전극 홀더에 은색 와이어를 설치합니다. 기록 전극의 경우, 와이어 1~2센티미터은 전극 홀더의 끝 부분에서 내다해야합니다. 더 선은 참조 전극에 대해 남아있을 수 있습니다.
- 실버 와이어에 AgCl 겉옷을 추가하려면, 0.1 M NaCl에서 와이어를 위치와 1.5-9 V DC 전원 소스의 긍정적인 단자에 전극 홀더를 연결합니다. 전원의 단자는 전기 0.1 M NaCl 용액에 연결되어 있어야합니다. 10 분 동안 진행 chloriding 반응을 허용합니다. 녹음 및 참조 전극 사이에 정전기를 맞춰야하기 위해 짧게 녹음 장치에 설치하기 전에 함께 전극을 만지지.
- 유리 micropipette의 풀러를 사용하여 모세관 당겨. 모세관의 끝에 개통은 직경 50-10 미크론 주위해야합니다.
- 그것은 은색 와이어보다 ~ 2cm 이상 때문에 모세관의 뭉툭한 끝을 점수와 끊다에 다이아몬드 연필을 사용합니다. 화재 - 폴란드어 부탄 토치로 잘라 끝을.
- 수정 링어의 용액에 0.5 % 아가로 오스를 용융. 전송 피펫을 사용하여 전극의 끝부분에 용융 아가로 오스 솔루션의 작은 금액을 당기세요.
- 수정 링어의 솔루션 (이 목적을 위해 유용 온수와 긴 얇은 끝을을 가지고 뽑아왔다 주사기)를하는 방법 1 / 2에 대한 뽑아 모세를 입력합니다. 부드럽게하는 기포를 이동시키다하는 모세관이 끄적. 그들이 사용할 준비가 될 때까지 아래에 수정된 링어의 솔루션의 소량으로 저장 병에 가득 전극을 저장합니다. 조직 샘플 준비 및 녹음을위한 준비가되면, 기록 전극 와이어를 통해 채워진 모세관을 설치합니다.
3 부 : 준비 odorant 솔루션
odorants의 아밀 아세테이트와 heptaldehyde 큰 반응을 보여주고과 EOG 각성제 등 때문에 좋은 선택입니다.
- microcentrifuge 튜브에서 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 odorant의 dilutions 일련의 준비를합니다. 복용 - 반응 곡선의 시작점으로, 5 M 5-10 배 dilutions을 준비 × 10 -6 M. 매일 신선한 dilutions하십시오.
- 또한 실리콘 stoppers과 이온스 병의 4.9 MLS의 물과 DMSO 100 μL 희석 주식을 혼합하여 물에 50 배 odorants를 희석. 솔루션은 적어도 30 분 동안 병에 평형하자. 각 병에 odorants의 증기 농도가 알 수없는 것을 참고, 그러나 액상에서 odorants의 농도의 함수로 달라질 수 있습니다.
- p로 실리콘 마개를 통해이 18 게이지 바늘을 삽입rovide 입력 및 출력 포트. 병 사용하지 않을 때는 포트 연결해야합니다.
파트 4 : EOG와 분석 데이터를 기록
- 잘린 다음 CO 2 안락사 또는 마취 과다 복용하여 마우스를 희생. 두개골을 overlying 피부를 제거하고 sagittally 정중선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다.
- 장착 접시에 머리 절반, 중간 측면을 탑재합니다. 조심스럽게 turbinates을 폭로하기 위해 심장을 제거합니다.
- 녹화 무대에 탑재 조직과 접시를 놓습니다. turbinates의 기록 위치가 현미경 중심 있도록 무대를 맞춥니다.
- turbinate 표면에 humidified 공기를 제공하기 위해 공기 탱크를 켭니다. 위치 공기 공급 튜브 있도록 그것이 약 10mm 떨어진 녹음 위치에서이다. 유속은 ~ 600 ML / 분입니다.
- 로우 패스 1 kHz에서에서 필터와 100X에서 이득과 DC 모드 (AC 증폭은 EOG 신호의 유물을 유발합니다)에 앰프를 설정합니다.
- micromanipulators에 마운트 녹화 및 참조 전극.
- 장착 접시에 잘으로 참조 전극을 절감하고 그것이 전기 조직에 연결되어 그러한 수정 링어의 솔루션을 커버.
- turbinate IIB 또는 III의 표면에 기록 전극을 신중하게 낮추십시오. 전극 겨우 후각 상피의 표면을 만지지해야합니다! 전극이 상피 접촉되면 (즉 전기 회로를 완료) 직선 기준은 오실로 스코프에 표시됩니다.
- 공기 공급 튜브의 측면 포트에 odorant 병을 연결합니다.
- 컴퓨터에서 자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집에 대한 샘플링 속도는 2 kHz에서 이상되어야합니다. 이 소프트웨어는 냄새 펄스를 트리거하고 녹음을 시작합니다.
- 전형적인 자극 프로토콜 100 밀리초 펄스가 1 초 간격으로 구분하여 결합하여 100 밀리초 기간 단일 펄스, 또는 10 초 지속 펄스 수 있습니다.
- 조직이 최소한 적응하므로 프로토콜 사이의 시간을 허용합니다. 한 분 아밀 아세테이트와 최대 10 -3 M에 heptaldehyde의 액체 농도에 충분이며 높은 농도에서 5 분 수 있습니다. 높은 악취 농도 (예 : 복용 - 반응 곡선의 끝에 등) 제공 후 잔여 냄새는 튜브에 남아있을 수 있습니다. 95 % 에탄올과 공기 튜브를 세척 및 추가 조직 샘플을 계속하기 전에 건조.
- Axograph 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 매개 변수를 측정하기위한 도구를 제공합니다. 이러한 매개 변수는 응답 진폭, 대기 시간, 최대 시간과 종료 시간 상수를 포함합니다. 그것은 디지털 자세한 분석을하기 전에 25 Hz에서에서 흔적을 필터링하는 것이 바람직하다 수 있습니다.
대표 결과
그림 1. 분석 EOG에 대한 매개 변수입니다. EOG의 일부 매개 변수는 응답 진폭, 대기 (자극이 시행하고 반응이 시작되었을 때 사이의 시간), 상승 시간 (시작 사이의 시간을 포함하여 생쥐 사이에 반응의 비교에 대해 특히 유용합니다 응답 및 피크), 최대 시간 (자극의 시작에서 응답의 피크에 시간), 그리고 종료 일정 시간 (τ, 하나의 지수 방정식에 대한 응답의 붕괴 단계를 피팅에 의해 결정 ). 이러한 지연 시간, 상승 시간 및 종료의 지속 시간 운동 매개 변수의 비교 들어, 이전에 분석하기 위해 응답의 최대 진폭을 정상화하는 것이 좋습니다.
그림 2. 대표 다른 자극 프로토콜에 따라 신호를 EOG. 자극에 대한 응답으로 마우스 EOGs의 (A) 예가 아밀 아세테이트의 농도 증가와 함께. 패널의 상단에있는 검은색 라인은 odorant의 자극의 타이밍과 기간을 나타냅니다. 전설의 농도는 액체 용액의 농도입니다. (B) 선량 - 반응 관계 다섯 생쥐에서 평균. 오차 막대는 95 % 신뢰 간격입니다. 최대 진폭의 감소는 종종 매우 높은 악취 농도에서 관찰됩니다. (C) 이점 - 펄스 자극에 대한 응답으로 EOG의 예제. odorant의 하나의 짧은 펄스가 몇 초 동안 지속적인 적응을 elicits. (D) 10 초에 대한 응답으로 EOG의 예제는 odorant의 자극을 인정합니다. EOG는 지속 odorant 프레 젠 테이션 도중 desensitization을 보여줍니다.
Discussion
이 프로토콜에서 설명하는 설정으로, 후각 상피의 표면에 odorant의 자극은 정확한 odorant 농도 및 역학 알 수없는 경우에도, 야생 유형 및 돌연변이 생쥐 간의 비교있게 조직 준비 사이의 일관성을 것입니다. 여러 가지 요인, 특히 녹음 위치와 humidified 공기의 흐름 속도는 EOG 변화의 원인이됩니다. 케어는 변화를 최소화하기 위해 동일한 turbinate에 유사한 위치에서 레코드로 이동한다. 이것은 쉽게 일관 머리 같은 측면에서 녹음 및 현미경, 냄새 전달 관 및 조직 샘플 사이의 변경되지 않은 공기 테이블에 micromanipulators의 발자국을함으로써 얻을 수 있습니다. 조직의 과도한 건조를 방지하기 위해 절개 후뿐만 아니라, 조직 샘플은 즉시 humidified 공기 흐름에 배치해야합니다.
생쥐에 EOG 녹음도 7, 14, 15, 또는 머리는 그대로두고 turbinates 16, 17 위에 뚫고 작은 구멍에 전극을 삽입하여이 turbinates 준비 마우스 액체 살포 장치와 함께 진행하실 수 있습니다. EOG 녹음의 각 변화는 자신의 강점을 갖고 있습니다 :이 프로토콜에 설명된 조직 준비에 공기 위상 녹음 설정의 최소 금액을 요구하고 수행하는 가장 쉬운되며 액체 살포 장치를 사용하여 녹음 약리 시약의 사용을 촉진,하지만 많은 odorants의 소수성 특성은 악취 배달 복잡, 마지막으로, 머리가 그대로 남아있는 기록은 '인공 도청'실험에 사용할 수 전극 배치는 turbinates가 완전히 노출하는 경우보다 힘들지만.
Disclosures
생쥐는 존스 홉킨스 대학의 동물 케어 및 사용위원회의 승인 방법으로 처리하고 euthanized되었다.
Acknowledgments
우리는 박사 Yijun 노래, 그리고 생물의학과, 조언과 도움을 존스 홉킨스 대학의 Hattar Kuruvilla 조의 트라이 - 연구실 구성원 감사합니다. NIH 교부금 DC007395 DC009946 및 지원.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
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