Summary
وelectroolfactogram (EOG) هو تسجيل بالمعلومات ، طريقة سهلة لقواعد السلوك ، وموثوق بها لتقييم وظيفة حاسة الشم عند مستوى الظهارة الشمية. يصف هذا البروتوكول على إعداد تسجيل ، والماوس إعداد الأنسجة ، وجمع البيانات وتحليل البيانات الأساسية.
Abstract
الحيوانات تعتمد على حاسة الشم لسلوكيات الكثير من الحرج ، مثل العثور على مصادر الغذاء وتجنب الحيوانات المفترسة ، وتحديد conspecifics عن التزاوج والتفاعلات الاجتماعية الأخرى. وelectroolfactogram (EOG) هي طريقة تسجيل بالمعلومات وسهل السلوك ، ويمكن الاعتماد عليها لتعمل فحص حاسة الشم عند مستوى الظهارة الشمية. منذ 1956 وصفا للEOG بواسطة Ottoson في الضفادع 1 ، وقد تم تطبيق تسجيل EOG في الفقاريات بما في ذلك العديد من السلمندر والأرانب والجرذان والفئران والبشر (استعرضها سكوت وسكوت جونسون ، 2002 ، المرجع 2). وقد أذكت التطورات الحديثة في مجال التعديل الوراثي في الفئران الفائدة في تسجيل EOG الفسيولوجية لتوصيف وظيفة حاسة الشم في خارج تدق وتدق في الفئران. وقد تم تطبيقها بنجاح تسجيلات EOG للتدليل على الدور المركزي للالشمية مكونات نقل الإشارة 3-8 ، ومؤخرا لتوصيف مساهمة آليات تنظيمية معينة لردود OSN 12/09.
الكشف عن الرائحة يحدث على سطح الظهارة الشمية على أهداب OSNs من حيث تتالي تنبيغ الإشارة يؤدي إلى فتح قنوات ايون ، وتوليد الحالية التي تصب في وأهداب الغشاء depolarizes 13. وEOG هو السلبية المحتملة المسجلة خارج الخلية على سطح الظهارة الشمية على تحفيز الرائحة الناتجة عن محصلة للتغيرات المحتملة التي تنجم عن استجابة OSNs الفردية في مجال تسجيل 2. مقارنة بين السعة وحركية من EOG بالتالي توفير معلومات قيمة حول كيفية التعديل الجيني والتلاعب تجريبية أخرى تؤثر على الإشارات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابة لOSN الرائحة.
نحن هنا وصفا للتسجيل EOG الهواء المرحلة على إعداد القرائن الماوس الشمية. لفترة وجيزة ، وبعد التضحية الماوس يتعرض لها القرائن التي تتوسط الشمية الرأس على طول خط الوسط وإزالة الحاجز. ثم يتم وضع إعداد المحارة في الإعداد التسجيل ، ويتم وضع قطب كهربائي في تسجيل سطح الظهارة الشمية على واحدة من القرائن وسطي. متصلا كهربائيا القطب إشارة إلى النسيج من خلال حل العازلة. هو في مهب تيار مستمر من الهواء مرطب على سطح البشرة لإبقائها رطبة. هو ينفخ بخار الحلول الرائحة في تيار من الهواء مرطب لتحفيز ظهارة. يتم تسجيل الاستجابات والرقمية لمزيد من التحليل.
Protocol
الجزء 1. الإعداد تسجيل EOG
جهاز تسجيل تتكون من القطب التسجيل ، مسرى المرجعية ، أنبوب الهواء التسليم ، المرحلة العينة ، ومجهر تشريح ، وكلها ترتكز على جدول الهواء داخل قفص فاراداي. وتستخدم لوضع Micromanipulators الأقطاب وأنبوب توصيل الهواء. وانفجر تيار الهواء المستمر من خلال الماء المقطر لإضافة الرطوبة قبل أن تمر عبر أنبوب توصيل الهواء وأكثر من العينة. ويستخدم 60 مم طبق الثقافة مليئة Sylgard إلى عمق 6-8 ملم وتصاعد لسطح العينة. وتجويف بئر وقناة للخروج من Sylgard في صحن متزايدة لتوفير وسيلة للاتصال كهربائيا القطب اشارة الى حل عبر تعديل عينة رينغر.
هناك علاقة بين هذا القطب والقطب تسجيل اشارة الى مكبر للصوت. وترسل إشارات من مكبر للصوت الى التحويل الرقمي ، ثم إلى جهاز الكمبيوتر. ويمكن استخدام برامج مثل مسجل المحاور أو pClamp للسيطرة على بروتوكول التحفيز ، لتسجيل الإشارات ، وتحليل لاحقة من الاستجابات. يمكن لتوصيل الذبذبات مكبر للصوت بعد أن تكون مريحة لرصد الوقت الحقيقي من الجهد الكهربائي أثناء وضع القطب تسجيل وخلال التسجيلات EOG.
يتم التحكم التسليم من المحفزات من قبل Picospritzer الرائحة ، وهذا مرتبط إلى نفس الكمبيوتر المستخدمة للحصول على إشارة. تم تعيين ضغط الهواء في Picospritzer إلى 10 رطل في البوصة المربعة. ويمكن استخدام خزان الهواء واحد ومنظم لتزويد الهواء على كل طاولة الهواء وPicospritzer و. ويتم استخدام خزان الهواء الثاني ومنظم لتوفير الهواء للتيار الهواء مرطب ، وهذا يتطلب خفض ضغط وكمية كبيرة من تدفق الهواء. قبيل تقديم حافز الرائحة ، ويرتبط الإخراج Picospritzer إلى زجاجة الرائحة. ثم يتم توصيل الزجاجة الرائحة في أنبوب توصيل الهواء.
الجزء 2 : إعداد الأقطاب
القطب تسجيل هو سلك الفضة chlorided في كوب سحبت الشعرية مليئة الحل تعديل رينغر (135 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 1 ملم CaCl 2 ، 1.5 ملم MgCl 2 ، 10 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، تصفية تعقيمها). القطب المرجع سلك الفضة chlorided.
- تثبيت الأسلاك الفضية في حامل الالكترود. للتسجيل الكهربائي ، ينبغي 1-2 سم من الأسلاك تبرز من نهاية حامل الكهربائي. يمكن ترك المزيد من سلك كهربائي للمرجعية.
- إضافة إلى معطف AgCl سلك الفضة ، وسلك في موقف كلوريد الصوديوم 0.1 M وتوصيل حامل القطب الموجب لمصدر الطاقة الخامس 1،5-9 العاصمة. يجب أن يكون السالب لمصدر الطاقة متصلة كهربائيا في حل كلوريد الصوديوم 0.1 M. السماح للتفاعل chloriding المضي قدما لمدة 10 دقيقة. لمعادلة أي تهمة ثابتة بين القطب تسجيل والمرجعية ، بإيجاز الأقطاب معا قبل تثبيتها على جهاز تسجيل.
- سحب الزجاج الشعرية باستخدام مجتذب micropipette. يجب فتح في غيض من شعري بحوالي 50-10 ميكرون في القطر.
- استخدام قلم رصاص ليسجل الماس وقطع نهاية حادة من شعري ولذلك فمن ~ 2 سم أطول من سلك الفضة. النار تلميع نهاية قطع مع الشعلة البوتان.
- ذوبان agarose 0.5 ٪ في محلول تعديل رينغر. سحب كمية صغيرة من محلول agarose المصهور الى غيض من القطب الكهربائي باستخدام ماصة نقل.
- ملء الشعرية سحب حوالي 1 / 2 على الطريق مع الحل تعديل رينغر (حقنة الذي تم تسخينه وسحبت أن يكون لها نهاية فترة طويلة رقيقة من المفيد لهذا الغرض). نفض الغبار بلطف الشعرية لطرد أي فقاعات هواء. مخزن القطب شغلها في جرة تخزين مع كمية صغيرة من محلول رينغر تعديل في القاع حتى تكون جاهزة للاستخدام. مرة واحدة في عينات الأنسجة مستعدة وجاهزة للتسجيل وتثبيت الشعرية شغل أكثر من سلك كهربائي تسجيل.
الجزء 3 : حلول إعداد الرائحة
وخلات الأميل odorants وتستثير ردود heptaldehyde كبيرة وخيارات جيدة على النحو EOG المنشطات.
- في أنابيب microcentrifuge ، وإعداد سلسلة من التخفيفات من الرائحة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). كنقطة انطلاق لمنحنى الاستجابة للجرعة ، وإعداد 10 أضعاف التخفيفات في الفترة من 5 إلى 5 م × 10 -6 م. جعل التخفيفات جديدة كل يوم.
- كذلك تمييع odorants 50 ضعفا في المياه عن طريق خلط 100 سهم المخفف في ميكرولتر DMSO بالماء تراخيص 4.9 في زجاجات اوقية (الاونصة) 2 مع سدادات السيليكون. السماح للحلول يوازن في زجاجات لا يقل عن 30 دقيقة. نلاحظ أن تركيز بخار odorants في كل زجاجة غير معروف ، ولكن سوف تختلف كدالة للتركيز odorants في المرحلة السائلة.
- إدراج اثنين من عيار 18 عن طريق الإبر السدادة السيليكون لعrovide الإدخال والإخراج الموانئ. وينبغي أن تسد المنافذ عندما الزجاجة ليست في استخدامها.
الجزء 4 : تسجيل البيانات وتحليلها EOG
- تضحية الماوس بواسطة القتل الرحيم CO 2 أو جرعة زائدة من مخدر تليها قطع الرأس. إزالة الجلد المغطي الجمجمة وشطر sagittally الرأس على طول خط الوسط.
- جبل نصف الرأس ، وحتى الجانب الإنسي ، على طبق المتزايدة. إزالة الحاجز بعناية لفضح القرائن.
- مكان الطبق مع الأنسجة المركبة على خشبة المسرح تسجيل. محاذاة المرحلة بحيث يتم توسيط موقع التسجيل على القرائن تحت المجهر.
- بدوره على خزان الهواء لإيصال الهواء إلى السطح ترطيب المحارة. موقف التسليم أنبوب الهواء بحيث يكون حوالي 10 ملم بعيدا عن مكان التسجيل. معدل التدفق ~ 600 مل / دقيقة.
- تعيين مكبر للصوت للوضع DC (AC التضخيم سوف تحفز التحف في إشارة EOG) مع المنخفضة تمرير التصفية في 1 كيلو هرتز ، وكسب في 100X.
- جبل تسجيل وأقطاب المرجعية على micromanipulators.
- انخفاض القطب المرجعية في البئر على الصحن وتغطية متزايدة مع الحل تعديل رينغر بحيث يتم توصيل كهربائيا على الأنسجة.
- بعناية أقل القطب تسجيل على سطح المحارة للبنك أو الثالث. وينبغي أن القطب بالكاد تلمس سطح الظهارة الشمية! عند القطب يأتي في اتصال مع ظهارة (أي اكتمال الدائرة الكهربائية) في الأساس على التوالي وسوف تظهر في الذبذبات.
- إرفاق زجاجة الرائحة إلى ميناء جنب على تسليم أنبوب الهواء.
- على الكمبيوتر ، والشروع في وضع بروتوكول التحفيز. يجب أن معدل أخذ العينات للحصول على البيانات هو 2 كيلو هرتز أو أعلى. يقوم البرنامج يؤدي الى نبض الرائحة ويبدأ التسجيل.
- ويجوز للبروتوكول نموذجي يكون التحفيز نبض مدة 100 مللي ثانية واحدة ، المقترنة 100 ميللي ثانية البقول مفصولة فاصل زمني 1 ثانية ، أو 10 ثانية ، نبض المستدام.
- السماح لبعض الوقت بين بروتوكولات بحيث يتم تكييف الحد الأدنى من الأنسجة. دقيقة واحدة كافية لتركيز السائل من خلات الأميل وheptaldehyde تصل إلى 10 م -3 ؛ في تركيزات أعلى سماح 5 دقائق. بعد تسليم تركيزات عالية رائحة (مثل في نهاية منحنى الاستجابة للجرعة) قد تبقى رائحة متبقية في أنبوب. غسل أنبوب الهواء مع الايثانول 95 ٪ وجافة قبل المستمر مع عينات من الأنسجة الإضافية.
- مسجل المحاور البرنامج يوفر أدوات لقياس البارامترات الرئيسية للإشارة EOG. معلمات تشمل هذه السعة ردا على ذلك ، الكمون ، والوقت الى ذروتها ، والثوابت وقت الانهاء. قد يكون من المرغوب فيه لتصفية آثار رقميا عند 25 هرتز قبل إجراء مزيد من التحليل.
ممثل النتائج
الشكل 1. معلمات EOG التحليل. المعلمات العديد من EOG مفيدة بشكل خاص للمقارنة بين ردود الفئران ، بما في ذلك السعة ردا على ذلك ، والكمون (الوقت بين عند إدارة التحفيز ويبدأ الاستجابة) ، وارتفاع الوقت (الوقت بين بداية للاستجابة وذروة) ، ومرة إلى الذروة (الوقت من بدء التحفيز إلى ذروة الاستجابة) ، والوقت ثابت إنهاء (τ ، التي تحددها المناسب للمرحلة اضمحلال الرد على المعادلة الأسية واحد ). للمقارنة بين المعلمات الحركية مثل الكمون ، والوقت الارتفاع ، والوقت ثابت الإنهاء ، فإنه من المستحسن لتطبيع السعة القصوى للردود قبل التحليل.
الشكل 2. ممثل EOG إشارات بموجب بروتوكولات مختلفة التحفيز (أ) أمثلة على EOGs من ماوس ردا على التحفيز مع زيادة تركيزات خلات الأميل. خط أسود في أعلى لوحة تدل على توقيت ومدة التحفيز الرائحة. التركيزات في الأسطورة هي تركيز المحلول السائل. (ب) بالنسبة لمتوسط الاستجابة للجرعة من خمسة فئران. أشرطة الخطأ وفترات الثقة 95 ٪. ويلاحظ في كثير من الأحيان انخفاض في السعة الذروة رائحة بتركيزات عالية جدا. (ج) مثال EOG ردا على التحفيز إقران النبض. نبضة واحدة قصيرة من الرائحة تثير تكيف دائم لعدة ثوان. (د) استمرار مثال EOG ردا على التحفيز - 10 ثوانى الرائحة. وتظهر الحساسية EOG الرائحة أثناء العرض المستمر.
Discussion
مع الإعداد الموصوفة في هذا البروتوكول ، فإن الرائحة المحفزات على سطح الظهارة الشمية تكون متسقة بين الاستعدادات الأنسجة ، والسماح للمقارنة بين الانواع البرية وفئرانا معدلة وراثيا ، على الرغم من تركيز الرائحة الدقيق والديناميات غير معروفة. عوامل عدة ، لا سيما الموقع وتسجيل معدل تدفق الهواء مرطب ، تسبب تغيرات في EOG. وينبغي الحرص على سجل من مواقف مشابهة على المحارة نفسها للحد من التباين. يمكن بسهولة يمكن تحقيق ذلك من خلال تسجيل باستمرار من الجانب نفسه من الرأس والحفاظ على البصمة من المجهر ، ورائحة أنبوب التسليم ، وmicromanipulators على الطاولة دون تغيير الهواء بين عينات الأنسجة. بالإضافة ، يجب أن عينات الأنسجة على الفور وضعت في مجرى الهواء مرطب بعد تشريح لمنع جفاف المفرط للنسيج.
ويمكن أيضا تسجيلات EOG على الفئران أن تنفذ مع جهاز نضح السائل على استعداد الماوس القرائن 7 ، 14 ، 15 ، أو من خلال ترك الرأس سليمة وإدخال القطب الى حفر حفرة صغيرة فوق القرائن 16 و 17. كل الاختلاف من تسجيل EOG وقوتها الخاصة : الهواء مرحلة التسجيلات على الاستعدادات الأنسجة كما هو موضح في هذا البروتوكول يتطلب الحد الأدنى من الإعداد وهي الاسهل في السلوك ؛ التسجيلات باستخدام جهاز نضح السوائل تسهيل استخدام الكواشف الدوائية ، على الرغم من أن طبيعة مسعور من odorants العديد من تعقيد التسليم رائحة ؛ أخيرا ، يمكن استخدام التسجيلات التي تركت سليمة في الرأس "مصطنعة شم' التجارب ، على الرغم من موضع القطب هو أكثر صعوبة مما كانت عليه عندما يتم كشفها بالكامل القرائن.
Disclosures
وقد تم التعامل مع الفئران والموت الرحيم مع الأساليب المعتمدة من قبل لجان رعاية الحيوان واستخدم من جامعة جونز هوبكنز.
Acknowledgments
نشكر الدكتور Yijun سونغ ، وأعضاء كوروفيلا حتر تشاو ثلاثي المختبر التابع لإدارة علم الأحياء ، جامعة جونز هوبكنز للحصول على المشورة والمساعدة. بدعم من المنح والمعاهد الوطنية للصحة DC007395 DC009946.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W.
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
