Summary
Rat MSC var isolerade från lårben och skenben och sedan berikats av magnetiska cell sortering. Sorterade celler bekräftades för uttrycket av yta markörer med flödescytometri. Dessa celler har även odlade på klonal täthet bilda enstaka kolonier och sedan dessa kolonier var åtskilda av kloning cylindrar.
Abstract
MSC är en population av adulta stamceller som är en lovande källa för terapeutiska tillämpningar. Dessa celler kan isoleras från benmärgen och kan lätt skiljas från hematopoetiska stamceller (HSCs) på grund av deras plast följsamhet. Detta protokoll beskriver hur man isolera MSC från råtta lårben och skenben. Den isolerade celler var ytterligare berikas mot två MSC ytan markörer CD54 och CD90 av magnetiska cell sortering. Redovisning av ytan markörer CD54 och CD90 har sedan bekräftats genom flödescytometri analys. HSC markör CD45 ingick också att kontrollera om det sorterade MSC var uttömda av HSCs. MSC är naturligtvis mycket heterogena. Det finns subpopulationer av celler som har olika former, spridning och förmågor differentiering. Dessa delpopulationer uttrycka alla de kända MSC markörer och ingen unik markör har ännu fastställts för de olika subpopulationer. Därför är en alternativ metod att skilja ut de olika subpopulationer med hjälp av kloning cylindrar att skilja ut en enda koloni härstammar celler. De celler som härrör från engångs-kolonierna kan sedan odlas och utvärderas separat.
Protocol
1. Isolering av Rat MSC
Mesenkymala stamceller isolerades från 6 till 8 veckor gamla Sprague-Dawley kvinnlig råtta som tidigare beskrivits 1, 2. Isolerade MSC kan ansluta sig till plastyta och enkelt utöka vid in vitro-kultur.
- Djuret togs i en anestesi kammare och nedsövd för cirka fem minuter. Under anestesi, observera graden av blinkande, andning och motorisk aktivitet. Ta bort djuret från kammaren omedelbart efter den stannar motorik och blinkande takt blev sällan.
- Lägg djuret ner på en operation station och döda animaliska halsdislokation. Skär av lårben och skenben från baksidan benen, ta bort hud och muskler.
- Sätt dissekerade lårben och skenben hos 70% isopropanol i några sekunder och transfer till 1X D-PBS.
- I en biosäkerhet skåp var lårben och skenben överförs till en 10cm maträtt som innehåller DMEM. Varje ben har sedan hållits med pincett och de två ändarna skars öppna med en sax. Fäst en 22g nål i en 3 ml spruta och fyll den med DMEM och spola märgen i en 50ml tub genom att sätta nålen till en öppna änden av benet. Upprepa 2 ~ 3 gånger för varje ben. När alla squash erhölls, resuspendera celler och passera cellsuspension genom en 70μm cell sil för att ta bort benet skräp och aggregat blod.
- Spinn ner celler på 200g, 4 ° C i 5 minuter och avlägsna supernatanten genom aspiration. Resuspendera cellerna i 25ml MSC medium (DMEM innehållande 10% FBS och 1% Pen-Strep). 10ml cellsuspension var seedade i varje 10cm kulturen maträtt för totalt två rätter. Håll kultur rätter i en 37 ° C och 5% CO 2 inkubator för 1 ~ 2 veckor. Medium ändrades var 2 ~ 3 dagar.
2. Anrikning av Rat MSC
Ett antal ytproteiner har använts för att berika MSC, inklusive CD54, CD90, CD73, CD105 och CD271 3-5. I vår studie har vi använt CD54 och CD90 som markörer för att berika MSC av magnetiska cell sortering.
- När celler nådde runt 80% confluency, aspirera på medellång och tillsätt 4 ~ 5 ml trypsin-EDTA till varje maträtt. Sätt disken tillbaka till inkubatorn och inkubera ca 5 minuter så att cellen lossnar. När cellerna var fristående, tillsätt lika mängd odlingsmedium att inaktivera trypsin. Samla cellsuspension i en 15ml tub och celler spinn ner på 200g, 4 ° C i 5 minuter.
- Nästa steg beskriver hur du berika MSC av två yta markörer CD54 och CD90 enligt manualen för cell separering med hjälp av BD IMagnet. Cellpelleten var suspenderade i cell färgning buffert (3% värmeinaktiverad FBS i 1X D-PBS) vid 20 miljoner celler / ml. Biotinylerad CD54 antikroppar (0.25μg per miljon celler) och biotinylerad CD90 antikroppar (0.15μg per miljon celler) inkom och blandas försiktigt med cellsuspension. Efter inkubering på is i 15 minuter, var märkta celler tvättas med ett överskott volym 1X BD imag buffert. Den märkta celler delades ner på 200g, 4 ° C i 5 minuter.
- Vortex BD imag streptavidin partiklar ordentligt, lägg 40μl partiklar för varje 10 miljoner celler. Blanda partikel med den märkta celler noggrant och inkubera cellerna på 6 ~ 12 ° C i 30 minuter. Detta gör att streptavidin partiklarna att binda till biotinylerad anti-CD54 och anti-CD90, som är bundna till ytan proteiner CD54 och CD90 respektive.
- Under inkubationstid, etikett en rundbottnad provrör för att samla den positiva fraktion. Efter inkubation, ta märkning volymen till 20 miljoner celler / ml med 1X BD imag buffert och överför de märkta cellerna till den positiva-fraktionen provröret. Placera den positiva-fraktion röret på BD IMagnet och låt det stanna i 6 minuter, avlägsna supernatanten med ett glas pasteurpipett med den positiva-fraktionen rör fortfarande på BD IMagnet.
- Ta bort den positiva-fraktion röret från BD IMagnet och placera den på is. Tillsätt 1 ml iskall 1X BD imag buffert och återsuspendera cellerna genom varsam blandning. Placera röret tillbaka på BD IMagnet och låt det stanna i 2 ~ 4 minuter. Avlägsna supernatanten med ett nytt glas pasteurpipett. Upprepa tvättningen som beskrivs i 2,5 en gång till.
- Ta bort röret från BD IMagnet och resuspendera cellerna i odlingsmedium, utsäde en 75cm 2 kolv för att upprätthålla celler och en 10 cm parabolantenn för flödescytometri.
3. Kontroll av Surface Marker Expression med flödescytometri
Flödescytometri analys utfördes för att verifiera de celler vi fått uttrycka CD54 och CD90. HSC markör CD45 användes för att bekräfta att MSC var uttömda av HSCs.
- När celler blir ~ 80% konfluenta, trypsinize celler med trypsin-EDTA och samla in celler i en 15ml tub. Centrifugera vid 200 g, 4 ° C i 5 minuter för att samla in celler.
- Aspirera supernatanten och varh celler med 1X D-PBS gång. Resuspendera cellerna i cell färgning buffert (1X D-PBS innehållande 2% FBS och 0,05% natriumazid) till en slutlig koncentration av 5 ~ 10 miljoner celler / ml och hålla cellerna på is. Alikvotera 100μl cellsuspension till den märkta sex rören (1 celler endast, 2. Isotypisk kontroll IgG2a,.. 3 isotypisk kontroll IgG1, 4 CD45, 5. CD54,.. 6 CD90).
- Lägg isotyp kontroller och primära antikroppar vid lämpliga koncentrationer (IgG2a och IgG1: 20μl per miljon celler, CD45: 0.5μg per miljon celler, CD54: 0.25μg per miljon celler, CD90: 0.15μg per miljon celler) och inkubera vid 4 ° C 30 minuter.
- Tvätta cellerna med 1X D-PBS två gånger och sedan resuspendera celler i 100μl cellfärgning buffert. Lägg SA-PE (streptavidin-fykoerytrin, använd 0.15μg per miljon celler) och inkubera vid 4 ° C i 30 minuter i mörker.
- Tvätta märkta celler med 1X D-PBS två gånger. Resuspendera cellerna i 400μl cellfärgning buffert och överför till en falk slang för flödescytometri analys.
4. Separation av Single-koloni Derived MSC
MSC är en heterogen befolkning sammansatt av olika delpopulationer med olika cell-form, tillväxt samt differentiering förmåga 6. Men alla delpopulationer uttrycker kända MSC markörer och det är därför inte möjligt att använda markörer för att skilja ut dessa subpopulationer. Därför tillämpade vi kloning cylindrar att skilja ut de olika delpopulationer, som kolonier bildas av enstaka celler.
- Tavla celler vid ca 50 ~ 100 celler per 10cm maträtt. Inkubera i 37 ° C och 5% CO 2 inkubator för 1 ~ 2 veckor. Under denna period undersöka väl isolerade kolonier med ett inverterat mikroskop. När kolonierna har nått tillräckligt stor storlek (bättre fler än 100 celler i varje koloni), markera kolonier med en Sharpie längst ner i skålen. När plocka kolonin ska märkas, se till att det inte finns några omgivande kolonier nära plockade ett.
- Aspirera medium och tvätta skålen en gång med 1X D-PBS. Plocka upp en steril kloning cylinder med en steril tång och försiktigt placera den runt den markerade kolonin. Upprepa detta tills alla markerade kolonierna har en kloning cylinder placeras över. Den plockade kolonier bör vara långt borta från varandra så att varje kloning cylindern bara innehåller en koloni.
- Lägg 100μl Trypsin-EDTA till varje kloning cylinder och sätta skålen tillbaka till inkubator för ~ 5 minuter. Efter 5 minuter, kontrollera cellerna under mikroskop för att se om de är avrundning uppåt. När cellerna har lyfts upp, tillsätt lika mängd odlingsmedium att inaktivera trypsin. Blanda cellsuspension med en 200μl mikropipett och överföra cellsuspension till en 60mm maträtt som innehåller 3 ml uppvärmd odlingsmedium. Märk disken ordentligt och lägg tillbaka dem in i inkubatorn. Spårning morfologiska förändringar under de närmaste dagarna.
5. Representativa resultat
Enligt det protokoll som beskrivs i den del som råttan MSC isolering bör plast fastsittande MSC synas nästa dag efter plätering. När celler fortsätter att föröka sig, bör konfluenta cellerna ser ut som de celler som visas i figur 1A. När celler når ~ 80% confluency (figur 1B) kan subkultur genomföras. Under subkultur har trypsin-EDTA används för att lösgöra celler och lyfte cellerna är små och runda som visas i Figur 1C.
Figur 1. Faskontrast bilder av råtta MSC. (A) konfluenta MSC. Majoriteten av celler är spindel-liknande eller stjärnliknande. (B) MSC cirka 80% confluency. (C), lyft celler efter trypsinization är små och runda.
När MSC berikas av magnetiska cellsortering är flödescytometri analys utföras för att kontrollera uttrycken ytan markör. Om anrikning är bra, bör de celler som visar positiv färgning mot MSC markörer CD54 och CD90 men negativt mot HSC markören CD45 (Figur 2). Isotyp kontroller IgG2a och IgG1 används som negativa kontroller.
Figur 2. Flödescytometri analys av MSC för utanpåliggande markörer. MSC var märkta med antikroppar mot IgG2a (isotypisk kontroll 1), IgG1 (isotypisk kontroll 2), CD45, CD54 och CD90. MSC uttryckte CD54 och CD90 men inte CD45.
När celler seedas på rätt klonat täthet bör kolonier öka från enstaka celler. Figur 3a är en koloni består av en enda cell. Kloning cylindrar kan sedan användas för att separera kolonier och celler som härrör från kolonierna kan odlas separat. Figur 3B och 3C representerar celler från två enskilda kolonier. De celler som härrör från kolonin 1 är spindeln som (Figur 3B) medan celler från kolonin 2 är runda (Figur 3C).
Figur 3. Koloni bildande genom MSC och enda koloni härstammar celler. MSC odlade på klonal individ täthet bildar kolonier. Dessa kolonier kan separeras genom kloning cylindrar och celler från olika kolonier kan odlas separat. (A) en representant koloni bildas av MSC då klädd i klonat densitet. (B) Spindel-liknande celler från en koloni. (C) Runda celler som härrör från en annan koloni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man isolera och berika MSC. En metod att separera enda kolonin härstammar celler är också införlivas. Det finns flera steg som är viktiga för en lyckad isolering, anrikning och koloni separation. Medan du gör celler isolerade från råtta, rekommenderas att filtrera genom en cell sil eller en steril nylonmesh av liknande storlek för att bli av blodproppar och ben skräp. Efter förkromning cellerna natten kommer många döda celler vara flytande i det mediet och döda celler avlägsnas genom att ersätta med nya medel som bör bidra till tillväxten av den bifogade celler.
Den magnetiska cellsortering i detta protokoll beskriver hur du utför en positiv selektion, och liknande förfaranden kan användas för att utföra ett negativt urval. Mängden antikroppar som ska läggas till kan skilja sig och optimering krävs för att uppnå bättre sortering. Detta gäller även för märkning av celler för flödescytometri analys. Om inte kör analys flödescytometri för den märkta prover omedelbart, kan prover fästas med 2% formaldehyd och köra senare. Dock är långtidsförvaring rekommenderas inte eftersom detta tenderar att öka auto-fluorescens och offer prov kvalitet.
Den viktigaste delen för kolonin separationen är sådd på rätt celltätheten (som bör optimeras experimentellt) och lokalisera enskilda kloner som inte är omgivna av andra kloner. Om det finns andra kloner i närheten, kan kloning cylindern omfattar de närliggande kloner och de erhållna celler inte längre kommer från en klon. Vid placering av kloning cylindern över klon också vara noga med att inte dra det över skålen ytan eftersom detta kommer att leda till att kisel fettet i botten av kloning cylindern för att täcka de celler och hindra trypsin från att nå de celler för att lossa dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbetet stöddes delvis av National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 och R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0.941.055) och MSU-stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
