Summary
Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.
Abstract
MSC's zijn een populatie van volwassen stamcellen, dat is een veelbelovende bron voor therapeutische toepassingen. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg en kan gemakkelijk worden gescheiden van de hematopoietische stamcellen (HSC's) als gevolg van hun plastic therapietrouw. Dit protocol wordt beschreven hoe u MSC's te isoleren van de rat dijbeen en dij. De geïsoleerde cellen werden verder verrijkt tegen twee MSC oppervlakte markers CD54 en CD90 door magnetische celsortering. Uitdrukking van oppervlakte markers CD54 en CD90 werden vervolgens bevestigd door flowcytometrie-analyse. HSC marker CD45 was ook opgenomen om te controleren of de gesorteerde MSC's waren uitgeput van HSC. MSC's zijn van nature nogal heterogeen. Er zijn subpopulaties van cellen die verschillende vormen, proliferatie en differentiatie mogelijkheden hebben. Deze subpopulaties alle drukken van de bekende MSC markers en geen unieke marker is nog niet geïdentificeerd voor de verschillende subpopulaties. Daarom wordt een alternatieve benadering te scheiden van de verschillende subpopulaties met behulp van het klonen van cilinders te scheiden van single-kolonie afgeleide cellen. De cellen, afkomstig van de single-kolonies kunnen vervolgens worden gekweekt en afzonderlijk geëvalueerd.
Protocol
1. Isolatie van Rat MSC's
Mesenchymale stamcellen werden geïsoleerd uit 6-8 weken oud Sprague-Dawley vrouwelijke rat zoals eerder beschreven een, twee. Geïsoleerde MSC's kunnen zich aan plastic oppervlak en gemakkelijk uit te breiden tijdens de in vitro cultuur.
- Het dier werd in een kamer anesthesie en verdoofd voor ongeveer vijf minuten. Tijdens de narcose, acht de snelheid van knipperen, ademhaling en motorische activiteit. Haal de dieren uit de kamer onmiddellijk na het stopt motorische activiteit en de knipperende tarief werd zeldzaam.
- Leg het dier neer op een operatie station en doodt het dier door cervicale dislocatie. Snij het dijbeen en de dij van de rug ledematen, verwijder de huid en spieren.
- Doe de ontleed dijbeen en de dij in 70% isopropanol voor een paar seconden en transfer naar het D-1X PBS.
- In een bioveiligheid kabinet, waren de dijbeen-en dij overgebracht naar een 10 cm schotel met DMEM. Elk bot werd toen gehouden met een pincet en de twee uiteinden werden opengesneden met een schaar. Bevestig een 22G naald aan een 3 ml spuit en vul deze met DMEM, spoel het beenmerg in een 50ml buis door het inbrengen van de naald een open einde van het bot. Herhaal de 2 ~ 3 keer voor ieder been. Toen alle pompoenen werden verkregen, resuspendeer de cellen en langs de celsuspensie door middel van een cel 70μm zeef tot op het bot puin en het bloed aggregaten te verwijderen.
- Spin down cellen in 200g, 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant door aspiratie. Resuspendeer cellen in 25ml MSC medium (DMEM met 10% FBS en 1% pen-Strep). 10 ml celsuspensie werd gezaaid in elke cultuur schotel 10 cm voor een totaal van twee gerechten. Houd de cultuur gerechten in een 37 ° C en 5% CO 2 incubator voor 1 ~ 2 weken. Medium werd veranderd om de 2 ~ 3 dagen.
2. Verrijking van Rat MSC's
Een aantal van de oppervlakte-eiwitten zijn gebruikt om MSC's te verrijken, zoals CD54, CD90, CD73, CD105 en CD271 3-5. In onze studie gebruikten we CD54 en CD90 als markers om MSC's te verrijken door magnetische celsortering.
- Wanneer de cellen ongeveer 80% confluentie bereikt, zuigen het medium en voeg 4 ~ 5 ml trypsine-EDTA bij elk gerecht. Plaats de schalen in de broedstoof en incubeer gedurende ongeveer 5 minuten naar cel onthechting mogelijk te maken. Zodra cellen werden losgemaakt, voeg gelijke hoeveelheid van de cultuur medium tot trypsine te inactiveren. Verzamel celsuspensie in een 15 ml buis en de spin-cellen neer op 200g, 4 ° C gedurende 5 minuten.
- De volgende stappen beschrijven hoe MSC's te verrijken door twee oppervlakte markers CD54 en CD90 volgens de handleiding voor het gebruik van BD celscheiding IMagnet. Celpellet werd geresuspendeerd in cel verkleuring buffer (3% door warmte geïnactiveerd FBS in 1X D-PBS) bij 20 miljoen cellen / ml. Gebiotinyleerd CD54 antilichaam (0.25μg per miljoen cellen) en CD90 antilichaam gebiotinyleerd (0.15μg per miljoen cellen) werd toegevoegd en voorzichtig gemengd met de celsuspensie. Na incubatie op ijs gedurende 15 minuten werden de gelabelde cellen gewassen met een overmaat volume van 1X BD Imag buffer. De gelabelde cellen werden gecentrifugeerd bij 200g, 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Vortex de BD Imag streptavidine deeltjes grondig, voeg 40μl deeltjes voor elke 10 miljoen cellen. Meng het deeltje met de gelabelde cellen grondig en incubeer de cellen op 6 ~ 12 ° C gedurende 30 minuten. Hierdoor kan de streptavidine deeltjes te binden aan de gebiotinyleerde anti-CD54 en anti-CD90, dat gebonden is, respectievelijk aan de oppervlakte-eiwitten CD54 en CD90.
- Tijdens de incubatie tijd, het etiket een ronde bodem reageerbuis met de positieve fractie te verzamelen. Na incubatie, breng de etikettering volume tot 20 miljoen cellen / ml met 1X BD Imag buffer en de overdracht van de gelabelde cellen met de positieve-fractie collectie buis. Plaats de positieve-fractie buis op de BD IMagnet en laat het verblijf voor 6 minuten, dan is het supernatans verwijderen met een glazen pipet Pasteur met de positieve-fractie buis nog steeds op de BD IMagnet.
- Verwijder de positief-fractie los van de BD IMagnet en plaats het op ijs. Voeg 1 ml ijskoude 1X BD Imag buffer en resuspendeer cellen door voorzichtig mengen. Plaats de buis op de BD IMagnet en laat het verblijf voor 2 ~ 4 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een nieuwe glazen Pasteur pipet. Herhaal het wassen, zoals beschreven in 2.5 nog een keer.
- Haal de buis uit de BD IMagnet en resuspendeer cellen in kweekmedium, zaad een 75cm 2 fles voor het behoud van de cellen en een 10 cm schotel voor flowcytometrie.
3. Verificatie van de Surface Marker Expression door middel van flowcytometrie
Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd om de cellen kregen we uitdrukken CD54 en CD90 te controleren. De HSC marker CD45 werd gebruikt om te bevestigen dat de MSC's waren uitgeput van HSC.
- Wanneer de cellen zich ~ 80% confluent, trypsinize cellen met trypsine-EDTA en het verzamelen van cellen in een 15 ml buis. Centrifugeer bij 200g, 4 ° C gedurende 5 minuten om cellen te verzamelen.
- Zuig het supernatant en wash cellen met 1X D-PBS een keer. Resuspendeer cellen in cel verkleuring buffer (1X D-PBS met 2% FBS en 0,05% natriumazide) tot een uiteindelijke concentratie van 5 ~ 10 miljoen cellen / ml en houden cellen op ijs. Aliquot 100μl celsuspensie in de zes gelabelde buizen (1 cellen alleen, 2. Isotype controle IgG2a,.. 3 isotype controle IgG1, 4 CD45, 5. CD54,.. 6 CD90).
- Voeg isotype controle en primaire antilichamen op geschikte concentraties (IgG2a en IgG1: 20μl per miljoen cellen, CD45: 0.5μg per miljoen cellen, CD54: 0.25μg per miljoen cellen, CD90: 0.15μg per miljoen cellen) en incubeer bij 4 ° C voor 30 minuten.
- Was de cellen met 1X D-PBS twee keer en vervolgens resuspendeer cellen in 100μl cel verkleuring buffer. Voeg SA-PE (streptavidine-phycoerythrin, gebruik 0.15μg per miljoen cellen) en incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
- Was gelabelde cellen met 1X D-PBS twee keer. Resuspendeer cellen in 400μl cel verkleuring buffer en over te dragen aan een falcon buis voor flowcytometrie-analyse.
4. Scheiding van Single-kolonie Derived MSC's
MSC is een heterogene populatie bestaat uit verschillende subpopulaties met verschillende cel-vorm, groei en differentiatie capaciteit 6. Echter, alle subpopulaties express de bekende MSC markers en daarom is het niet haalbaar om markers te gebruiken te scheiden van deze subpopulaties. Daarom hebben we toegepast klonen cilinders te scheiden van de verschillende subpopulaties, die kolonies gevormd door individuele cellen.
- Plaat cellen op ongeveer 50 ~ 100 cellen per 10cm schotel. Incubeer in een 37 ° C en 5% CO 2 incubator voor 1 ~ 2 weken. Tijdens deze periode, onderzoeken goed geïsoleerde kolonies met een omgekeerde microscoop. Nadat de kolonies hebben bereikt groot genoeg grootte (beter meer dan 100 cellen in elke kolonie), markeer de kolonies met een sharpie op de bodem van de schotel. Wanneer kiezen de kolonie te worden gemarkeerd, zorg ervoor dat er geen kolonies rond de buurt van de gekozen een.
- Aspireren medium en een keer was de schotel met D-1X PBS. Pak een steriel klonen cilinder met een steriele pincet en voorzichtig te plaatsen rond de gemarkeerde kolonie. Herhaal dit tot alle gemarkeerde koloniën heeft een cilinder geplaatst over het klonen. De geplukt koloniën moet ver weg zijn van elkaar zodanig dat elke klonen cilinder bevat alleen een kolonie.
- Voeg 100μl trypsine-EDTA voor elke cilinder en het klonen weer de schotel naar de incubator voor ~ 5 minuten. Na 5 minuten, controleer dan de cellen onder de microscoop om te zien of ze aan toe zijn afronding. Wanneer de cellen verhoogd hebben, voeg gelijke hoeveelheid van de cultuur medium tot trypsine te inactiveren. Meng de celsuspensie met een 200μl micropipettor en breng de celsuspensie op een 60mm schotel met 3 ml voorverwarmd kweekmedium. Goed het etiket van de borden en leg ze terug in de incubator. Tracking morfologische verandering in de komende paar dagen.
5. Representatieve resultaten
Volgens het protocol beschreven in het gedeelte voor de rat MSC isolatie moeten plastic klevende MSC's te zien zijn de volgende dag na plating. Als cellen blijven woekeren, moet de samenvloeiing cellen lijken op de cellen in figuur 1A. Wanneer de cellen bereiken ~ 80% confluentie (Figuur 1B), kan subcultuur worden uitgevoerd. Tijdens de subcultuur, was trypsine-EDTA gebruikt om cellen los en tilde cellen zijn klein en rond, zoals aangegeven in figuur 1C.
Figuur 1. Fase contrast beelden van de rat MSC's. (A) Confluent MSC's. De meerderheid van de cellen zijn spindel-achtige of ster-achtig. (B) MSC's ongeveer 80% confluentie. (C) Lifted cellen na behandeling met trypsine zijn klein en rond.
Zodra MSC's worden verrijkt door magnetische celsortering, is flowcytometrie-analyse uitgevoerd om de oppervlakte marker uitdrukkingen te controleren. Als de verrijking is goed, de cellen moeten positieve kleuring tegen MSC markers CD54 en CD90 maar negatief zien ten opzichte van de HSC marker CD45 (Figuur 2). Isotype controle IgG2a en IgG1 worden gebruikt als negatieve controles.
Figuur 2. Flowcytometrie-analyse van MSC's voor oppervlakte-merkers. MSC's werden gemerkt met antilichamen tegen IgG2a (isotype controle 1), IgG1 (isotype controle 2), CD45, CD54 en CD90. MSC's uitgedrukt CD54 en CD90, maar niet CD45.
Wanneer de cellen worden gezaaid op de juiste klonale dichtheid, moet kolonies stijgen van enkele cellen. Figuur 3A is een kolonie gevormd door een enkele cel. Klonen cilinders kan vervolgens worden gebruikt om afzonderlijke de kolonies en cellen, afkomstig van de kolonies kunnen afzonderlijk worden gekweekt. Figuur 3B en 3C staat voor cellen, afkomstig van twee individuele kolonies. De cellen, afkomstig van een kolonie zijn as, zoals (figuur 3B), terwijl de cellen, afkomstig van kolonie 2 zijn ronde (figuur 3C).
Figuur 3. Kolonie de vorming van MSC's en single-kolonie afgeleide cellen. MSC gekweekt op klonale dichtheid vorm individuele kolonies. Deze kolonies kunnen worden gescheiden door het klonen van cilinders en cellen uit verschillende kolonies kunnen afzonderlijk worden gekweekt. (A) Een vertegenwoordiger kolonie gevormd door MSC's als geplateerd op klonale dichtheid. (B) Spindel-achtige cellen afgeleid van een kolonie. (C) Ronde cellen afkomstig van een andere kolonie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren en te verrijken MSC's. Een methode om de single-kolonie afgeleide cellen apart is ook opgenomen. Er zijn verschillende stappen die belangrijk zijn voor een succesvolle isolatie, verrijking en kolonie scheiding. Terwijl het doen van celisolatie van rat, is het raadzaam te filteren door middel van een cel zeef of een steriele nylon mesh van vergelijkbare grootte om zich te ontdoen van de bloedstolsels en het bot puin. Na de beplating van de cellen 's nachts, zullen veel dode cellen worden zwevend in het medium en de dode cellen worden verwijderd door het vervangen met vers medium die de groei van de bijgevoegde cellen moeten helpen.
De magnetische celsortering in dit protocol wordt beschreven hoe u een positieve selectie, en soortgelijke procedures kunnen worden gebruikt om een negatieve selectie uit te voeren. De hoeveelheid antilichamen worden toegevoegd, kunnen verschillen en optimalisatie nodig is om betere sortering te bereiken. Dit geldt ook voor het labelen van de cellen voor flowcytometrie-analyse. Als niet wordt uitgevoerd flowcytometrie-analyse voor het gelabelde monsters direct kunnen monsters worden vastgesteld met 2% formaldehyde en lopen later. Echter, langdurige opslag niet aanbevolen, aangezien dit de neiging om verhoging van de auto-fluorescentie en opoffering sample kwaliteit.
Het belangrijkste onderdeel van de kolonie scheiding is zaaien op de juiste celdichtheid (die experimenteel moet worden geoptimaliseerd) en lokaliseren van enkele klonen die niet omringd zijn door andere klonen. Als er andere klonen in de buurt, kan het klonen cilinder omvatten de nabijgelegen klonen en de verkregen cellen zullen niet meer vanuit een kloon. Bij het plaatsen van het klonen cilinder over de kloon, ook oppassen niet te glijden over het gerecht oppervlak omdat dit de siliconenvet oorzaak op de bodem van het klonen cilinder naar de cellen te dekken en het trypsine te voorkomen dat het bereiken van de cellen om ze los te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het werk werd mede ondersteund door het National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439, en R21GM075838), National Science Foundation (cbet 0.941.055) en de MSU Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X D-PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Biotin mouse IgG2a | BD Biosciences | 555572 | |
| Biotin mouse IgG1 | BD Biosciences | 555747 | |
| Biotin anti-rat CD54 | Cedarlane Labs | CL054B | |
| Biotin anti-rat CD90 | Cedarlane Labs | CL005B | |
| Biotin anti-rat CD45 | Cedarlane Labs | CL001B | |
| BD Imag buffer | BD Biosciences | 552362 | |
| Round-bottom tube | BD Biosciences | 352063 | |
| Streptavidin particles | BD Biosciences | 557812 | |
| SA-PE | R&D Systems | F0040 | |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C2059 |
References
- de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells. J Neurochem. 91, 155-166 (2004).
- Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells. J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Kassem, M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther. 15, 109-116 (2008).
- Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. Krause Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102, 3483-3493 (2003).
- Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).
