불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피
Summary
세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis – (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호 작용<em> 생체내에</em엄격한 단백질 복잡한 정화 기술을 사용하여 격리 수 있습니다>. 여기 immunoprecipitation에 의해 단백질 단지의 절연 다음 문화의 성장 crosslinking 전지에 대한 기술을 제시한다.
Abstract
세포 기계의 동적 특성은 자주 일시적 및 / 또는 약한 단백질 연결에 내장되어 있습니다. 이러한 낮은 친화도 상호 작용 관심의 단백질 주변의 분리 및 단백질 네트워크의 식별에 대한 엄격한 방법을 배제. 화학 crosslinkers의 사용은 따라서 정화에 대한 생화 학적 한계를 거치지 않고 불안 정한 상호 작용의 선택 안정화 수 있습니다. 여기에 우리가의 스페이서 팔로 homobifunctional crosslinker를 사용하는 문화의 세포에 대한 의무 프로토콜을 현재 12, dithiobis – (succinimidyl proprionate) (DSP). DSP는 분자에 존재 disulphide 결합의 감소에 의해 죽습니다. 자석 구슬과 관심의 단백질의 면역 크로마 토그래피와 결합 가교 달리 정화 견딜 않을 단백질 단지의 절연을 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적인 서양 얼룩 기술과 호환되며 그것은 대량 분석법 1 단백질 식별을 위해 확장할 수 있습니다.
스테파니 A. Zlatic와 진주 V. 라이더이 작품에 동일하게 기여.
Protocol
Discussion
DSP, 멤브레인 – 침투성, 12의 스페이서 암과 화학적 줄이할 수있는 crosslinker는 과도 단백질 상호 작용 1,2,3,4를 안정화하는 데 사용됩니다. 여기서 우리는 어댑터 복잡한 AP – 3 5 endosomes에서 vesicles에 막 단백질을 인식하고 각종 가용성 단백질 복합이 전략을 exemplified. AP – 3 선택 아연 수송 ZnT3 및 지질 키나제 phosphatidylinositol – 4 – 키나제 타입 II 알파지만 트랜스페린 수용체 1,4,6에</…
Acknowledgements
이 작품은 VF에 국립 보건원 (NS42599 및 GM077569)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate. J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).
- Xiang, C. C. Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling. Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).
- Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic. Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).
- Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery. J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).
- Salazar, G. The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation. Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).
- Trinkle-Mulcahy, L. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
