Cellen genomsläppliga crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionat)] stabiliserar övergående och labil interaktioner<em> In vivo</em>, Som gör sin isolering med hjälp av stränga proteinkomplex reningstekniker. Här presenterar vi en teknik för crosslinking celler som odlas i kultur följt av isolering av protein komplex med immunoprecipitation.
Abstract
Den dynamiska karaktären av cellulära maskineri ofta bygger på övergående och / eller svag protein föreningar. Dessa låg affinitet interaktioner utesluter stränga metoder för isolering och identifiering av protein nätverk kring ett protein av intresse. Användningen av kemiska bindemedel möjliggör selektiv stabilisering av labila interaktion, och därmed förbigå biokemiska begränsningar för rening. Här presenterar vi ett protokoll mottaglig för celler i kultur som använder en homobifunctional crosslinker med en spacer arm av 12 a, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP klyvs genom reduktion av en disulfid obligationer finns i molekylen. Bryggbindningen kombination med immunoaffinity kromatografi av proteiner av intresse med magnetiska kulor kan isolering av proteinkomplex som annars inte skulle klara reningen. Detta protokoll är kompatibelt med jämna Western Blot tekniker och det kan skalas upp för protein identifiering genom masspektrometri 1.
Stephanie A. Zlatic och Pearl V. Ryder bidragit lika för detta arbete.
Protocol
1. Förberedelser för crosslinking Du måste plattan ett tillräckligt antal celler för att möjliggöra isolering av 500 mikrogram protein per standard rör reaktion. Ett enda rör kan vara tillräckligt för identifiering av förmodade interactmedlemmar av ett protein av intresse genom immunoblot. I detta fall pärla bundna material kan elueras med SDS-PAGE prov buffert (immunoprecipitation). För masspektrometri analys bör antalet vanliga reaktioner ökas minst tio gånger och protein komplex bör eluer…
Discussion
DSP, ett membran som släpper igenom, kemiskt reduceras crosslinker med en spacer arm av 12 A används för att stabilisera transienta proteininteraktioner 1,2,3,4. Här har vi exemplifierat denna strategi med adaptern komplexa AP-3 ett lösligt protein komplex som känner igen och sorterar membranproteiner i blåsor från endosomes 5. AP-3 binds selektivt till zink transportör ZnT3 och lipid kinas fosfatidylinositol-4-kinas typ II alfa men inte transferrin receptor 1,4,6. Vi expanderad…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health till VF (NS42599 och GM077569).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Phosphate Buffered Saline
Invitrogen
P4417
Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM
Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP)
Thermo Scientific
22585
Moisture sensitive, store in air tight container 4°C
Zlatic, S. A., Ryder, P. V., Salazar, G., Faundez, V. Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (37), e1855, doi:10.3791/1855 (2010).