Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie
Summary
Die Zelle durchlässig Vernetzer DSP [Dithiobis-(Succinimidylpropionat)] stabilisiert vorübergehend und labile Wechselwirkung<em> In vivo</em>, Die ihre Isolation ermöglicht mit strengen Protein-Komplex Reinigungstechniken. Hier präsentieren wir eine Technik zur Vernetzung von Zellen in Kultur gezüchtet, durch Isolation von Protein-Komplexe durch Immunpräzipitation gefolgt.
Abstract
Die Dynamik der zellulären Maschinerie häufig auf vorübergehende und / oder schwache Protein-Assoziationen gebaut. Diese geringe Affinität Wechselwirkungen ausschließen strengen Methoden zur Isolierung und Identifizierung von Protein-Netzwerken um ein Protein von Interesse. Der Einsatz von chemischen Vernetzer erlaubt die selektive Stabilisierung der labilen Interaktionen, also unter Umgehung biochemischen Einschränkungen für die Reinigung. Hier präsentieren wir ein Protokoll zugänglich für Zellen in Kultur, dass ein homo Vernetzer verwendet mit einem Spacer-Arm von 12 Å, Dithiobis-(Succinimidyl proprionate) (DSP). DSP wird durch Reduktion einer Disulfidbrücke im Molekül gespalten. Die Vernetzung mit Immunaffinitätschromatographie der Proteine von Interesse mit magnetischen Beads kombiniert ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen, die sonst nicht überstehen würden Reinigung. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western-Blot-Techniken, und es kann bis zur Proteinidentifizierung skaliert werden durch Massenspektrometrie 1.
Stephanie A. Zlatic und Pearl V. Ryder trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Protocol
Discussion
DSP, eine Membran durchlässig, chemisch reduzierbaren Vernetzer mit einem Spacer-Arm von 12 Å wird verwendet, um transiente Protein-Interaktionen 1,2,3,4 stabilisieren. Hier haben wir diese Strategie mit dem Adapter-Komplex AP-3 ein lösliches Protein-Komplex, und erkennt möglichen Membranproteine in Vesikeln aus Endosomen 5 veranschaulicht. AP-3 bindet selektiv an die Zink-Transporter ZnT3 und der Lipid-Kinase-Phosphatidylinositol-4-Kinase-Typ-II-alpha, aber nicht Transferrin-Rezeptor <su…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, um VF (NS42599 und GM077569) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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