अस्थिर मल्टी प्रोटीन परिसर के अलगाव द्वारा Vivo में नियंत्रित पार से जोड़ने और इम्यूनो - चुंबकीय आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी सेलुलर
Summary
सेल पारगम्य डीएसपी crosslinker [dithiobis (succinimidyl propionate)] स्थिर क्षणिक और अस्थिर बातचीत<em> Vivo में</em>, जो उनके अलगाव की अनुमति देता कड़े प्रोटीन जटिल शोधन तकनीक का उपयोग. यहाँ हम crosslinking संस्कृति में विकसित कोशिकाओं immunoprecipitation द्वारा प्रोटीन परिसरों के अलगाव के बाद के लिए तकनीक मौजूद है.
Abstract
सेलुलर मशीनरी के गतिशील स्वभाव अक्सर क्षणिक और / या कमजोर प्रोटीन संघों पर बनाया गया है. ये कम आत्मीयता बातचीत अलगाव और ब्याज की एक प्रोटीन के चारों ओर प्रोटीन नेटवर्क की पहचान के लिए कड़े तरीकों रोकता. रासायनिक crosslinkers का उपयोग अस्थिर बातचीत के चुनिंदा स्थिरीकरण की अनुमति देता है, इस प्रकार की शुद्धि के लिए जैव रासायनिक सीमाओं को दरकिनार. यहाँ हम वर्तमान संस्कृति में कोशिकाओं के लिए उत्तरदायी प्रोटोकॉल है कि एक स्पेसर के हाथ के साथ एक homobifunctional crosslinker का उपयोग करता है 12 ए, dithiobis (proprionate succinimidyl) (डीएसपी). डीएसपी Disulphide अणु में मौजूद बांड की कमी से cleaved है. चुंबकीय मोतियों के साथ ब्याज की प्रोटीन का immunoaffinity क्रोमैटोग्राफी साथ संयुक्त क्रॉस को जोड़ने प्रोटीन परिसरों कि अन्यथा शुद्धि नहीं झेलने होगा अलगाव की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से पश्चिमी धब्बा तकनीक के साथ संगत है और यह प्रोटीन की पहचान के लिए किया जा सकता मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1 के द्वारा बढ़ाया है.
स्टेफ़नी ए Zlatic और पर्ल वी. राइडर इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
Discussion
डीएसपी, एक झिल्ली पारगम्य, 12 ए की एक स्पेसर भुजा के साथ रासायनिक कम करने योग्य crosslinker क्षणिक प्रोटीन 1,2,3,4 बातचीत को स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ हम एडाप्टर एपी 3 परिसर में एक घुलनशील प्रोटी?…
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य के VF संस्थान (NS42599 और GM077569) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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