Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade
Summary
A célula permeável reticulador DSP [dithiobis (succinimidyl propionato)] estabiliza interações transitória e instável<em> In vivo</em>, Que permite o seu isolamento usando técnicas de purificação de proteínas rigorosos complexo. Aqui nós apresentamos uma técnica para as células cultivadas em cultura de reticulação seguido pelo isolamento de complexos de proteínas por imunoprecipitação.
Abstract
A natureza dinâmica de máquinas celular é freqüentemente construída sobre associações de proteína transitória e / ou fraco. Essas interações de baixa afinidade impede métodos rigorosos para o isolamento e identificação de redes de proteínas em torno de uma proteína de interesse. O uso de reticuladores química permite a estabilização seletiva das interações lábil, ignorando assim as limitações bioquímicas para a purificação. Aqui apresentamos um protocolo favorável para células em cultura que usa um reticulador homobifunctional com um braço espaçador de 12 Å, dithiobis (succinimidyl proprionate) (DSP). DSP é clivada pela redução de uma ligação de dissulfeto presentes na molécula. Cross-linking combinada com cromatografia de imunoafinidade de proteínas de interesse com esferas magnéticas permite o isolamento de complexos de proteínas que, do contrário não resistiria a uma purificação. Este protocolo é compatível com técnicas regulares western blot e pode ser ampliada para identificação de proteínas por espectrometria de massa 1.
Stephanie A. Zlatic e Pearl V. Ryder contribuíram igualmente para este trabalho.
Protocol
Discussion
DSP, uma membrana permeável, reticulador quimicamente redutível com um braço espaçador de 12 Å é usado para estabilizar as interações proteína transitória 1,2,3,4. Aqui nós exemplificou essa estratégia com o complexo adaptador de AP-3 um complexo de proteínas solúveis que reconhece e classifica as proteínas da membrana em vesículas de endossomos 5. AP-3 se liga ao transportador de zinco ZnT3 e os lipídios quinase fosfatidilinositol-4-quinase tipo II alpha, mas não receptor de tran…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde para VF (NS42599 e GM077569).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | P4417 | Dissolve 1 tablet in 200 mL water; add MgCl2 to a final concentration of 1 mM and CaCl2 to a final concentration of 0.1 mM | |
| Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP) | Thermo Scientific | 22585 | Moisture sensitive, store in air tight container 4°C | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma | D2650 | ||
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma | T9284 | ||
| Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgG | Invitrogen | 110.31 | Beads are also available as sheep anti-rabbit | |
| Dyna-Mag-2 magnet | Invitrogen | 123-21D |
References
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