Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析

doi: 10.3791/187 Published: April 29, 2007

Summary

本视频演示所使用的技术准备从非洲爪蟾胚胎,包括使用的眉刀的组织者和动物极植 - 一个专门的清扫工具的眉。也给出了组装粘附实验的协议,目前表面上的组织者或动物极细胞,适当发展的关键,关键粘附分子的存在探头。

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

准备附着力钱伯斯(前一天注射/夹层)

黏附实验房

如果你有一个传统的复合式显微镜(舞台上方的光学定位),它是ncecessary低高度粘连室如下。如果使用倒置光学显微镜,然后“NUNC实验室TEK腔玻璃罩”可以被使用,并跳过步骤#1 - 2。

  1. 附上“压密封的硅绝缘体”40 x 24毫米盖玻片之一。用力按下绝缘体清洁台式盖玻片,从另一个侧面看,以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。

  2. 可选:将粘附在一个玻璃的Petri盘的Whatman滤纸和干燥周期中的反应釜消毒室。冷却下来到RT。

涂总商会

  1. 把200毫升液滴的钙粘蛋白(10mg/ml的)或纤维连接蛋白(20mg/ml)到蒸压粘连室的中心工作的解决方案,使用sigmacoated黄芽。在室温下孵育4小时。

  2. 取出的钙粘蛋白或纤维连接蛋白解决方案,并转移到1.5ml管。未来两个星期内,该解决方案可重复使用。

  3. 免除1X按揭证券 - H 500ml的4%BSA块室。在室温下孵育1小时。

  4. 吸BSA溶液。 500毫升1X MBS - H的清洗室两次。第二次洗涤后,吸出的MBS - H的大部分(不完全),并储存在密封容器内4℃这粘连商会是在未来2 - 3天。

动物第植体解剖和离解

  1. 孵育0.1倍MBS - H的注入胚胎,从蒸压1X按揭证券- H的稀释,非蒸压中期的某个时候进行小的细菌,可以扰乱分离的动物上限细胞。

  2. 60毫米菜1X巴特的琼脂糖板和CMF -按揭证券琼脂糖板,至少为样品的数量很多。蒸压1X MBS - H倒入1X巴特的板块。 CMF -按揭证券板块,倒入10毫升CMF -按揭证券。

  3. 当胚胎成为8.5阶段,开始在1X巴特板解剖的动物帽。 10 - 15%的样品植通常就足够了一项实验。

  4. 将动物第植到CMF的按揭证券板块。育植的45 - 60分钟,直到植是完全分离的。在每15分钟的温和鼓动将有助于解离。

细胞粘附实验

  1. 播种细胞:分装500毫升1X按揭证券 - H以上的部分,粘附实验分庭和涂料商会的步骤准备粘附室。传输从CMF的按揭证券板块的分离的动物第细胞粘附室使用一个sigmacoated和切碎黄芽P200。

  2. 可选:如果可能的话,小心吸中期约2 / 3中途不暴露在空气中的细胞, 。新增大约相同数量的新鲜MBS - H,以确保中期含有足够的钙2 +和Mg 2 +。

  3. 在室温下孵育45 - 90分钟。偶尔检查细胞,看看他们是否附加的底部表面。

  4. 现在你可以利用细胞在显微镜下的图片。

  5. 把网格载玻片上的附着力室。对齐粘附室的角落之一电网幻灯片的一个角落。点算并记录在几个不同的网格的贴壁细胞数量。

  6. 倒在一个大塑料桶(例如,特百惠等)的MBS - H 1L。轻轻把粘附幻灯片室桶的底部。旋转的轨道摇床在低速(50 - 60rpm)5分钟。

  7. 把粘连室对电网的幻灯片,调整室的角落电网幻灯片相同的角落,在本节中,细胞粘附实验步骤#5。计数保持在同一电网连接,你有洗涤之前算细胞数目。计算保持后洗去附着的细胞的百分比。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1x MBS-H Buffer Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS Buffer This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera Reagent Sigma-Aldrich E-2278 Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution Reagent Sigma-Aldrich F-1141 This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H Buffer BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips Tool
No.1 cover slips 40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator Tool Glace Bio-Labs JTR20-2.5 2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass Tool Fisher Scientific 12-565-471 2 wells/slides
Grid slide glass Tool or Finder graticule for cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).More

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter