Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

doi: 10.3791/187 Published: April 29, 2007

Summary

Это видео демонстрирует технику используют для приготовления организатором и эксплантов животных полюса от эмбрионов Xenopus laevis, в том числе использование бровь ножом - специализированный инструмент, рассечение из одного в бровь. Протокол для сборки сцепления анализа уделяется также, что зонды на наличие ключевых молекул адгезии присутствуют на поверхности организатором или животного полюса клетки, которые имеют решающее значение для правильного развития.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Подготовка Адгезия палат (за день до инъекции / рассечение)

Адгезия Пробирной палаты

Если у вас есть обычный микроскоп соединения (оптического находит над сценой), он ncecessary сделать малоэтажного адгезии камеру следующим образом. При использовании перевернутой оптикой микроскопа, то "Nunc Lab-Tek патрон покровного стекла" может просто быть использован, и пропустить шаги # 1 - 2.

  1. Прикрепите один из "пресс-к-уплотнение кремния изолятор» на 40 х 24 мм покровным стеклом. Плотно прижмите изолятора покровным стеклом на чистой настольные и посмотреть с другой стороны, чтобы убедиться, что изолятор полностью прилагается без каких-либо воздушных пузырьков.

  2. Дополнительно: Положите адгезии камер в стеклянном блюде Петри с Whatman фильтровальной бумаги и автоклава в сухом цикла стерилизации. Прохладный их к РТ.

Покрытие палаты

  1. Положить 200 мл капли рабочего раствора кадгерина (10mg/ml) или фибронектина (20mg/ml) на центр автоклавного камеры адгезии, используя sigmacoated желтый советы. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 часов.

  2. Выньте кадгерина или фибронектина решение и трансфер в 1,5 мл трубки. Это решение может быть использовано для следующих двух недель.

  3. Разлить 500 мл 4% BSA в 1x MBS-H для блокирования камеры. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.

  4. Аспирируйте решение BSA. Вымойте камеру с 500 мл 1x MBS-H в два раза. После второго мытья, аспирация большинство MBS-H (не полностью), и хранить в плотно закрытой таре при температуре 4 º С. Это сцепление камеры, что хорошо для следующих 2 - 3 дня.

Разбор и диссоциации эксплантов животных Cap

  1. Инкубируйте вводят эмбрионов в 0.1x MBS-H, разбавленный из автоклавного 1x MBS-H, а неавтоклавного среды когда-то несет мало микробов, которые могут нарушить диссоциированных клетки шапка животного.

  2. Сделать 1x Барта агарозном пластин и CMF-MBS агарозном пластин с 60мм блюда, по крайней мере больше, чем количество ваших образцов. Налейте автоклавного 1x MBS-H для пластин 1x Барта. Для CMF-MBS тарелки, залить 10 мл CMF-MBS.

  3. Когда эмбрионы стать этапе 8.5, начала вскрытия животных шапки в пластине 1x Барта. 10 - 15 эксплантов на образцы, как правило, достаточно для эксперимента.

  4. Передача эксплантов животных шапку CMF-MBS пластины. Инкубируйте эксплантатов в течение 45 - 60 минут, пока эксплантов полностью диссоциирован. Нежный волнений в каждые 15 минут поможет диссоциации.

Анализ клеточной адгезии

  1. Посев клеток: Внесите 500 мл 1x MBS-H для адгезии камеры подготовлен в действия, описанные в предыдущих разделах, Палаты адгезии покрытия и Пробирной палаты. Передача диссоциированных клетки шапка животное от CMF-MBS пластины сцепления камеру P200 с использованием sigmacoated и отрубленными желтый советы.

  2. Дополнительно: Если это возможно, тщательно подлизываться среде до примерно 2 / 3 до половины, не подвергая клетки воздуха. Добавьте примерно такое же количество свежего MBS-H, чтобы убедиться, что среда содержит достаточное Са 2 + и Mg 2 +.

  3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 - 90 минут. Проверьте клетки иногда, чтобы убедиться в их крепления на нижней поверхности.

  4. Теперь вы можете взять картину клетки под микроскопом.

  5. Положите сцепление камеры на стекле сетки. Совместите один из углов камеры адгезию к углу сетки слайда. Граф и записи количества прилагается клетки в нескольких различных сетей.

  6. Залить 1 л MBS-H в большое ведро пластика (например, Tupperware, и т.д.). Аккуратно положил камеру адгезии слайд на дно ведра. Поверните его на орбитальном шейкере в течение пяти минут на малой скорости (50 - 60rpm).

  7. Положите адгезии камеру обратно на сетку слайда, выравнивая же углу камеры к тому же углу сетки слайдов, как это было сделано на шаге № 5 настоящей статьи, Пробирной клеточной адгезии. Подсчитайте количество клеток, которые остаются прикрепленными на той же сетке, что вы насчитали до мытья. Рассчитать процент клеток, которые остаются прикрепленными после стирки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1x MBS-H Buffer Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS Buffer This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera Reagent Sigma-Aldrich E-2278 Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution Reagent Sigma-Aldrich F-1141 This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H Buffer BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips Tool
No.1 cover slips 40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator Tool Glace Bio-Labs JTR20-2.5 2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass Tool Fisher Scientific 12-565-471 2 wells/slides
Grid slide glass Tool or Finder graticule for cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).More

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter