Summary
Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur in
Abstract
De telomeer G-overhang structuur heeft al in vele eukaryoten, met inbegrip gist, gewervelde dieren, en Trypanosoma brucei. Het dient als substraat voor telomerase voor de novo telomeren DNA-synthese en is daarom belangrijk voor telomeren onderhoud. T. brucei is een protozoaire parasiet die veroorzaakt slaapziekte bij de mens en nagana bij rundvee. Eenmaal besmet zoogdier gastheer, T. brucei cel schakelt regelmatig haar oppervlakte-antigeen te ontwijken van de gastheer immuunsysteem aan te vallen. We hebben onlangs aangetoond dat de T. brucei telomeer structuur speelt een essentiële rol in de regulatie van oppervlakte-antigeen genexpressie, die cruciaal is voor T. brucei pathogenese. Echter, T. brucei telomeer structuur niet is uitgebreid als gevolg van de beperking van de methoden voor de analyse van deze gespecialiseerde structuur bestudeerd. We hebben nu met succes heeft de autochtone in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extension methods voor het onderzoek van de telomeren G-overhang structuur en een adapter ligatie methode voor de bepaling van de telomeren terminal nucleotide in T. brucei cellen. Hier zullen we beschrijven de protocollen in detail en vergelijken hun verschillende voordelen en beperkingen.
Protocol
1. Detecteren T. brucei telomeren G-overhang met behulp van inheemse In-gel hybridisatie 3
Principe (figuur 1): Onder autochtone staat, een eind-label (CCCTAA) 4 (TELC) oligo probe kan alleen hybridiseren aan het enkelstrengs telomeer G-overhang regio. De hybridisatie intensiteit is evenredig met de lengte van de overhang. Na denaturatie en neutralisatie, zal dezelfde sonde in staat zijn om te hybridiseren met de hele telomeer regio. De hybridisatie intensiteit is het totale DNA telomeer bedrag en kan gebruikt worden als een laad controle. Twee standaard controles voor dit experiment zijn hybridisatie met behulp van end-gelabeld (TTAGGG) 4 (telg) oligo sonde, die niet moet opleveren geen signaal als T. brucei cel heeft geen telomeren C-overhang structuur, en om de genomische DNA te behandelen met 3'-specifieke enkelstrengs exonucleasen zoals Exo I of Exo T voorafgaand aan de hybridisatie, die de inheemse TELC hybridisatie-signaal te elimineren.
Stap 1. Bereid je DNA pluggen voor Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)
Intact chromosomen worden van elkaar gescheiden door PFGE. Daarom is genomisch DNA bereid als DNA-stekkers.
- Begin met 100 ml bloed vormen cellen (1,5 à 2 miljoen cellen / ml) of 20 ml van de procyclische cellen (bij 10 miljoen cellen / ml).
- Los 1,6% lage smeltpunt (LMP) agarose in L-buffer (0,01 M Tris • CL pH 7,6, 0,02 M NaCl, 0,1 M EDTA pH 8,0) en het warm te houden bij 50 ° C.
- Oogst cellen door centrifugatie bij 1,5 ktpm, 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet met L buffer tot een eindconcentratie van 5 miljoen cellen / ml.
- Incubeer celsuspensie bij 42-50 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg een volume van LMP agarose tot een volume van cellen. Meng goed, maar snel.
- Aliquot 85 pi celsuspensie aan elke well van een wegwerp-plug mal (BioRad).
- Na 5-10 minuten of totdat de stekkers zijn gestolde, overdracht past in een 15 ml conische buis met 5 ml buffer L / 1% Sarkosyl. Voeg 100 ul van 250 mg / ml proteïnase K of een snuifje van proteïnase K poeder, meng goed, en incuberen bij 50 ° C gedurende 48 uur.
- Gooi de buffer, stoppen twee keer wassen met 5 ml van de L-buffer en herhaal proteinase K spijsvertering voor een ander 48 uur. Was stekkers met verse L buffer weer. Bewaar stekkers bij 4 ° C in L buffer. Deze pluggen moeten worden gebruikt binnen 2 weken.
Stap 2. Aparte intact T. brucei chromosomen met behulp van Pulsed Field Gel Elektroforese
- Bereid agarosegel
- Bereid 2-3 l van 0,5 x TBE-buffer en transfer naar de gel draaien kamer van een CHEF DRII (BioRad) eenheid. Stel de bedrijfstemperatuur, start de pomp, dan start de koelunit.
- Bereiding van 100 ml van een 1,2% agarosegel in 0,5 x TBE buffer. Cool agarose tijdens het instellen van de gel lade.
- Besluit het monster te bestellen. Vergeet niet om de DNA-standaard. Droog de kam en leg hem op een vlakke ondergrond. Plaats elke DNA-stekker op de juiste tand. Verwijder overmatige buffer rond de DNA-plug door aspiratie, zodat de stekker vasthouden aan de tand.
- Giet de agarose gel zonder het inbrengen van de kam. Laat het afkoelen tot 40-50 ° C (enkele minuten), en steek langzaam de kam met de bijbehorende stekkers in de gel. Zorg ervoor dat de stekkers niet glijden de kam. Laat de gel stollen. Verwijder de kam van de gel langzaam.
- Pulsed Field Gel Elektroforese
Lopen gel in een CHEF DRII unit: 700 s-1500 en peulvruchten, 2,5 V / cm, bij 12 ° C voor 120 uur.
Stap 3. Vlek en destain de agarosegel
Vlekken op de gel met 1μg / ml ethidiumbromide in 0,5 x TBE bij KT 1 uur daarna in 0,5 x TBE zonder ethidiumbromide gedurende 1 uur met zachte wiegen. Maak een foto van de gel.
Stap 4. Droog de agarosegel
Plaats de agarosegel op twee lagen van 3 mm Whatman papier en dekking van de gel met plastic wrap. Droog de gel bij RT (de gel mag niet worden verwarmd meer dan 50 ° C om te voorkomen dat een denaturatie van de DNA-monsters). Vervang de natte Whatman papieren met droog die na 2 en 4 uur drogen, respectievelijk. Houd het drogen totdat de gel volledig droog is. Dit kan 's nachts duren, afhankelijk van de droger.
Stap 5. Het etiket van de oligo-probes
Meng 1 pl van 50 ng / ul TELC of oligo telg met 1 pl van 10 x polynucleotide kinase (PNK) buffer, 5 ul γ [32P] ATP, 2 pi van DDH 2 O, en een pi van T4 PNK. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 90 ul van tnes buffer (10 mM Tris Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 1% SDS) aan het reactiemengsel.
Terwijl het labelen van de oligoes, bereiden een G-25 kolom: Doe wat glaswol in een 3 cc spuit en vul het neer strak met een pipet tip. Vul de spuit met Sephadex G-25 fijne (autoclaved in TE) om de 3 ml markering. Laat het regelen van het gewicht. Te zuiveren van de gemerkte probe: belasting van de sonde op de top van de kolom. Wassen met 700 pi van tnes buffer, en elueer met 600 ul tnes buffer. Als alternatief, zuiveren de gemerkte probe met behulp van een mini-Quick Spin ™ kolom (Roche Applied Science).
Stap 6: hybridisatie
- Kort nat de gedroogde gel in gedestilleerd water en wegspoelen eventuele Whatman papier geplakt op de gel
- Plaats de gel in een hybridisatie zak en voeg 20 ml hybridiztion buffer (0,25 M Na 2 HPO 4 pH7.2; 1 mM EDTA, 7% SDS; 1% BSA, gefilterd door 0.22 urn filter). Incubeer in een waterbad bij 50 ° C met zachte schommelen gedurende minstens een uur.
- Verwijder de pre-hybridisatie buffer. Kook de gelabelde probe voor 5 min en voeg deze toe aan 25 ml vers hybridisatiebuffer, filter-steriliseren van de mix met een 0,22 urn spuitfilter en direct toe te voegen de hybridisatie mix om de hybridisatie tas. Sluit de zak en plaats het in een ondiepe bak met warm water. Plaats de hele container in het water bad. Incubeer bij 50 ° C gedurende de nacht met zachte wiegen.
- Snij een kleine opening in de hybridisatie zak. Giet zo veel mogelijk de hybridisatie mix en sla het op in een 50 ml conische buis. Houd de sonde ingevroren bij -20 ° C. Haal de gel uit de hybridisatie zak en zet het in een container.
Bij deze stap zal alles HOT EN BEHOEFTEN uitgebreid schoonmaken (BENCH, SCREEN, schaar, ETC. Zorg ervoor dat dubbele lagen van handschoenen te dragen! - Was de gel in 4 x SSC gedurende 30 minuten bij 50 ° C. Vervangen met verse wasbuffer en tweemaal herhalen.
- Was de gel in 4 x SSC/0.1% SDS bij 50 ° C.
- Leg de gel op een stuk van 3 mm Whatman papier en licht droog de gel.
- Wikkel de gel met plasticfolie en bloot te stellen aan phosphorimager voor ~ 3 dagen
- Scan de phosphorimager
- Incubeer de gel in denatureren buffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) bij RT gedurende 30 min
- Was de gel in neutralisatie buffer (3 M NaCl, 0,5 M Tris • / Cl pH 7,0) bij RT gedurende 30 min
- Spoelen in gedestilleerd water gedurende 3 minuten
- Pre-hybridiseren bij 55 ° C gedurende 1 uur
- Herhaal de hybridisatie met behulp van dezelfde probe-bevattende hybridisatie mix bij 55 ° C gedurende de nacht.
- Was zoals hierboven beschreven, behalve bij 55 ° C.
- Wikkel de gel en bloot te stellen aan phosphorimager voor ~ 2 uur.
- Scan de phosphorimager. Normaliseren van de hybridisatie-signaal verkregen vóór denaturatie met die verkregen na denaturatie.
2. Bepaal de telomeren Terminal Nucleotide door adapter Ligatie 6
Principe (Figuur 2A & 2B): Een 5 'einde-gelabelde oligonucleotide uniek is geligeerd aan het 3' uiteinde van de G-overhang. Dit wordt bereikt door gloeien om specifieke aanvullende gids oligo. Alleen de unieke / gids oligo-adapter met sequenties compatibel met de telomeer G-overhang terminale sequenties zullen worden geligeerd. Voor T. brucei, kan telomeren beëindigen in een van de zes verschillende nucleotiden van de TTAGGG herhalingen. Vandaar dat zes verschillende gids oligoes worden gebruikt (TG1-TG6, figuur 2A). Na de ligatie wordt DNA gedigereerd met restrictie-endonucleasen en opgelost op een agarosegel.
- Kinase behandeling van de unieke oligo.
Mix 6 pl van 10 pmol / ul unieke oligo met 3 pi van 10x PNK Buffer, 5 ul γ [32 P] ATP, 14 ul van DDH 2 O, en 2 pl (10 U) van T4 PNK. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur. - Verwijderen zonder rechtspersoonlijkheid hot nucleotide.
Gebruik QIAquick nucleotide verwijderen van kit om de niet opgenomen hete ATP te verwijderen en het eind-gelabelde oligo elueren met 60 ul van elutiebuffer (uiteindelijke concentratie zou worden ~ 1 pmol / pi). - Gloeien unieke oligo te begeleiden oligo (om de adapter te maken).
Voeg 10 ul van gezuiverd unieke oligo tot en met 2 ul van elke gids oligo-en een pi annealing buffer (200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0). Doe buizen in een 85 ° C verwarmen blok en zet het vuur te blokkeren. Laat de buizen en het verwarmingsblok afkoelen tot kamertemperatuur. Dit duurt een paar uur. Indien in een haast, verbindingsleiding na 5 min elk tot 65 ° C, dan 37 ° C en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. - Ligeren adapters om genomisch DNA totaal.
Tot 2,5 pi van een intact genomisch DNA, voeg 4 pi van 5 x Ligase buffer, 10 pi van gegloeide oligos, 2,5 ul van DDH 2 O, en een pi van T4 DNA-ligase. Incubeer bij 16 ° C gedurende de nacht. - Restrictie endonuclease Spijsvertering
Tot en met 20 pi van ligatie product toe te voegen 3 pi van 10 x NEB buffer 4, 1,5 pi van AluI en MboI elk, en 4 il van DDH 2 O. Incubeer dit mengsel bij 37 ° C gedurende de nacht. - Elektroforese.
Voeg 3 ul van 10 x Oranje G kleurstof (50% glycerol, 0,5% Oranje G) aan elk monster. Laad de DNA-monsters op een 20x20 cm 0,7% agarosegel in 0,5 x TBE met 0,2 microgram / ml ethidiumbromide. Run op 30V voor 30 min, dan is continue met een hoger voltage, maar minder dan 120V op een totaal van 1000 v hr. Maak een foto van de gel met een liniaal naast de DNA-merker. - Droge gel en bloot te leggen.
Zet de agarose gel op een laag DE81 filter papier en twee lagen van 3 mm Whatman papier en dekking van de gel met plastic wrap. Droge gel bij RT. Expose de gedroogde gel om 's nachts phosphorimager.
3. Ligatie Mediated Primer Extension 6
Principe (Figuur 2A & 2C): een unieke oligonucleotide is geligeerd aan het 3 'G-overhang met specifieke terminale sequentie, bepaald door de complementaire sequenties in de adapter (gids) oligo. Na zuivering, de gemerkte gids oligo dat blijft gegloeid om de G-overhang/unique oligo is primer uitgebreid tot de SS-ds kruising met T4 DNA-polymerase, die streng verplaatsing en 5'-3 'exonuclease activiteiten van mist. De primer extension producten geven daarom de lengte van de G-overhang.
- Kinase behandeling van de gids en unieke oligoes
- Mix 20 ul van 10 pmol / ul unieke oligo met 10 pi van 10 x PNK buffer, 20 ui 5 x ligase buffer (die bestaat uit 10 mM ATP), 3 pi (30 U) van T4 PNK, en 47 ul van DDH 2 O . Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Meng 1 pl van 10 pmol / ul gids oligo met 1 pl van 10 x PNK buffer, 2 pi van γ [32 P] ATP, 1 ui (10 U) van T4 PNK, en 5 ul DDH 2 O. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
- Gloeien gids oligo en unieke oligo
Voeg 10 pi (20 pmol) van de gefosforyleerde unieke oligo en 10 pi (10 pmol) van de eind-gelabelde oligo gids in een 1,5 ml Eppendorf buis (de 2:1-verhouding van die uniek zijn voor oligo gids zorgt ervoor dat alle gids oligo is gegloeid ). Volg dezelfde procedure zoals beschreven in protocol II voor gloeien oligoes. - Afbinden van de gegloeide gids / unieke oligo-adapter aan telomeren uiteinden
Volg dezelfde procedure zoals beschreven in protocol II voor DNA ligatie. - Neerslag DNA met 1 / 10 volume van natriumacetaat en 2,5 volume van de ijskoude ethanol bij -80 ° C gedurende 30 minuten. Spin down DNA pellet op 12 ktpm, 4 ° C gedurende 15 minuten. Was DNA met 70% ethanol en los op pallet in 10 uL van DDH 2 O.
- Primer extensie
Aan elke 10 pi DNA-monster toe te voegen 2 pi van 10 x T4 DNA Polymerase buffer, 1 ul van 1 mg / ml BSA, 1 ul van 25 mM dATP, dCTP en dTTP elk, 1 ui (3 U) van T4 DNA-polymerase, en 3 pi van DDH 2 O.
Maak een meester mengen met de polymerase, buffer, enz. en hoeveelheid geschikte hoeveelheid van de master mix aan elk DNA-monster. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten. Dan onmiddellijk aan toevoegen 1,2 pi van 0,5 M EDTA om de reactie. - Elektroforese
Run extension producten op een 10% acrylamide / 7 M urea/1xTBE gel. Belasting 4 pi van elk monster. Kook de monsters gedurende 10 minuten voorafgaand aan het laden. Uitvoeren bij 800V in 1x TBE tot de blauwe kleurstof bereikt de onderkant van de gel. Droog de gel bij 65 ° C gedurende 30 min daarna bij RT gedurende 30 min en bloot te stellen aan phosphorimager gedurende 2 uur.
De bereiding van 100 ml 10% polyacrylamide gel, te ontbinden 41 g ureum en 21 ml van 40% acrylamide-oplossing (acrylamide / bis-acrylamide 29:1) in 30 ml gedestilleerd water, voeg 10 ml van 10x TBE. Monteer glasplaten. Vlak voor het gieten van de gel, voeg 1 ml 10% APS en 100 pi van TEMED. Giet de gel en proberen eventuele luchtbellen te voorkomen.
4. Representatieve resultaten:
Detecteren T. brucei telomeer G-overhang structuur met behulp van inheemse in-gel hybridisatie
Intact T. brucei chromosomen van elkaar gescheiden door PFGE worden getoond in figuur 3A en 3B (links panelen). T. brucei cellen bevatten gewoonlijk ~ 100 exemplaren van minichromosomes, alle met een vergelijkbare grootte (50-150 kb) en migreren naar dezelfde positie op de gel (MC). Vanwege dit feit, na hybridisatie met TELC oligo sonde, de telomeer G-overhang signaal is het meest prominent op minichromosomes (Figuur 3A, middelste paneel). Hybridisatie met telg oligo probe normaal gesproken levert geen hybridisatie-signaal (Figuur 3B, middelste paneel), omdat T. brucei cellen hebben geen telomeren C-overhang structuur. Na denaturatie en neutralisatie, hybridisatie met ofwel TELC of telg oligo sonde moet uitwijzen telomeer signalen op alle chromosoom uiteinden (Figuur 3A en 3B, rechts panelen).
Bepaal de telomeer terminal nucleotide door adapter ligatie
Laden gelijke hoeveelheid DNA in elke baan is essentieel voor deze test, en dit wordt aangetoond door ethidiumbromide kleuring van de gel. Een voorbeeld hiervan is weergegeven in figuur 4A, linker paneel.
In dit protocol zijn de eind-gelabelde oligo uniek en begeleiden oligo adapters alleen geligeerd aan chromosoom eindigen als de telomeer G-overhangen eindigen met sequenties die compatibel zijn met de gids oligo. Si nce de unieke oligo is end-label, zal de ligatie product radioactief en geeft een sterk signaal. Zoals weergegeven in figuur 4A, rechter paneel, baan 1 geeft een sterk signaal, dat aangeeft dat een grote hoeveelheid unique/TG1 adapter is geligeerd aan het telomeer te beëindigen. TG1 heeft een eind filmpje van 5'CCCTAA3 '. Vandaar dat de telomeer G-overhang geligeerd aan deze adapter eindigen in 5'TTAGGG3 '. Er werden geen significante hoeveelheid ligatieproducten wordt waargenomen met behulp van andere gids oligoes, wat aangeeft dat de telomeren eindigend op TTAGGG de boventoon in de T. brucei cellen.
Het behandelen van het genomisch DNA met Exo I of Exo T, dat zijn 3 'overhang specifieke nucleasen, resulteerde in verlies van de ligatieproducten (Figuur 4A, rechter paneel, lanen 2 & 3), wat aangeeft dat de ligatie inderdaad het gevolg van de telomeer G- overhang structuur
Ligatie Mediated Primer Extension
Zonder ligatie, de eind-gelabelde oligo gids is 22 nt lang. Het laden van end-gelabelde oligo gids zou dienen als een negatieve controle en een grootte marker. (Figuur 4B, laan 11, sterretje geeft de eind-gelabelde oligo gids). We normaal gesproken zien ook een band van ~ 44 nt in deze negatieve controle (Figuur 4B, laan 11, open driehoek), die de grootste kans residu niet-gedenatureerde adapters. Na ligatie aan het chromosoom einde, de grootte van het uitgebreide product geeft de lengte van de G-overhang structuur. De meeste T. brucei telomeer G-overhangen eindigen in 5'TTAGGG3 '(Figuur 4A). Echter, deze G-overhang blijken zeer kort (slechts ~ 10 nt lang), als producten uitgebreid van de geligeerde TG1 gids oligo zijn niet veel langer dan de gids oligo zelf (Figuur 4B, baan 10), maar ze laten ligatie van TG1 adapter (Figuur 4A, rechter paneel, baan 1). Hoewel slechts een kleine hoeveelheid van TG4 adapter werd geligeerd aan de telomeren uiteinden (Figuur 4A, rechter paneel, baan 6), producten uitgebreid van geligeerde TG4 zijn veel langer (figuur 4B, baan 7, pijlpunten), met de langste product dat wordt ~ 55 nt. Vandaar dat we twee soorten van telomeren G-overhang waargenomen in T. brucei cellen. De overheersende telomeer G-overhangen eindigen in 5'TTAGGG3 ', maar zijn slechts ~ 10 nt lang. Weinig telomeer G-overhangen eindigen in 5'GGGTTA3 ', maar kan worden tot 40 nt lang. Beide soorten G-overhang zijn gevoelig voor Exo T (of Exo I) behandeling (Figuur 4A, rechter paneel, laan 2, 3, en 7; figuur 4B, baan 1, pijlen).
Figuur 1. Principe van autochtone in-gel hybridisatie. Linksaf, onder de inheemse conditie, de eind-gelabelde TELC oligo probe kan alleen hybridiseren met de single-stranded G-rijke telomeer overhang. De intensiteit van de hybridisatie weerspiegelt de lengte van de telomeren G-overhang. Rechts, na denaturatie, zal de TELC oligo probe hybridiseren met alle telomeer DNA. De intensiteit van deze kruising staat voor het totale bedrag van de telomeren DNA en wordt gebruikt als een laad-controle, en de laatste G-overhang niveau wordt berekend door de inheemse hybridisatie signaal door die verkregen na denaturatie.
Figuur 2. Principe van de adapter ligatie en ligatie-gemedieerde primer extensie. (A) sequenties van de unieke en zes gids oligoes. (B) Bepaal de telomeer terminal nucleotide door adapter ligatie. De unieke oligo is end-gelabeld (gemarkeerd met een rood sterretje), gegloeid de gids oligoes en geligeerd aan het telomeer te beëindigen. Alleen wanneer de unieke / gids adapter een 3 'overhang die compatibel is met de terminal telomeer volgorde zal de adapter worden geligeerd beren. (C) In ligatie-gemedieerde primer extensie, de gids oligo is end-gelabeld (gemarkeerd met een rood sterretje) en gegloeid om de unieke oligo voordat geligeerd aan het chromosoom eindigt. Alleen de unieke / gids adapter met een 3 'overhang compatibel met de G-overhang zal worden geligeerd. ^ Geeft aan dat de geligeerde phophordiester obligatie. Na verwijdering van de unligated oligo paren, zal primer extensie worden uitgevoerd met T4 DNA-polymerase, die streng verplaatsing en 5'-3 'exonuclease activiteiten van mist. De uiteindelijke lengte van de uitgebreide handleiding oligo weerspiegelt dus de lengte van de G-overhang.
Figuur 3. T. brucei telomeer G-overhang structuur geanalyseerd door native in-gel hybridisatie. (A) In-gel hybridisatie met TELC oligo sonde. (B) In-gel hybridisatie met telg oligo sonde. In beide (A) en (B) Links, Ethedium Bromide gebeitst PFG. Midden, inheemse hybridisatie resultaat. Rechts, post-denaturatie hybridisatie resultaat. Wild-type T. brucei cellen werden gebruikt. Intact of Exo Ik behandelde genomisch DNA werden gescheiden door PFGE. Open driehoek staat voor de megabase chromosomen, IC, tussen grote chromosomen, MC, minichromosomes.
"/>
Figuur 4. T. brucei telomeer G-overhang structuur geanalyseerd door ligatie-gemedieerde primer extensie. (A) De meeste T. brucei telomeer G-overhangen beëindigen 5'TTAGGG3 '. Links, Ethedium bromide gekleurde DNA-gel. Ongeveer gelijk hoeveelheid DNA is geladen in elke baan. Rechts, blootstelling resultaat van dezelfde gel na het drogen. Intact, Exo I-behandeling, of Exo T-behandelde DNA werd geligeerd aan zes verschillende end-gelabeld unieke / gids oligo-adapters zoals aangegeven. (B) T. brucei telomeren hebben korte G-overhangen. Intact of Exo T-behandelde genomisch DNA werd geligeerd aan zes verschillende unieke / gids oligo-adapters, gevolgd door primer extensie met T4 DNA-polymerase. End-gelabeld TG4 oligo was geladen als een negatieve controle (laan 11). De oligo zelf draait op 22 nt (*), maar gaf ook een zwakker signaal op ~ 44 nt (Δ). Alleen unique/TG4 adapter leverde extension producten aanzienlijk langer dan de gids oligo zelf (pijlpunten, baan 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypanosoma brucei veroorzaakt slaapziekte bij de mens. Deze ziekte, indien onbehandeld, is onvermijdelijk fataal. T. brucei cellen in zoogdieren gastheren ondergaan antigene variatie regelmatig, zodat de gastheer immuunsysteem aanvallen 7 te ontwijken. Daarom is het erg moeilijk uit te roeien T. brucei cellen zodra een infectie wordt vastgesteld. We hebben onlangs aangetoond dat telomeren een belangrijke rol spelen in de regulatie van de expressie van T. brucei oppervlakte-antigeen-gen 8. Daarom is het belangrijk om verder de functies van telomeren en de mechanismen te begrijpen voor de telomeren onderhoud in T. brucei cellen.
De telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase gemedieerde telomeren onderhoud 5. Methoden voor het meten van de telomeer overhang lengtes zijn waardevol voor het bestuderen van de mechanismen van de telomeren onderhoud. We hebben met succes heeft de autochtone in-gel hybridisatie 3 en ligatie-gemedieerde primer extensie 6 methode voor het analyseren van T. brucei telomeer G-overhang structuur en adapter ligatie methode voor de bepaling van de telomeren terminal nucleotide. Zowel de autochtone in-gel hybridisatie en de adapter ligatie methode kan onthullen het totale bedrag van de G overhang in de cel, maar alleen de ligatie-gemedieerde primer extensie kan de exacte G overhang lengte te onthullen.
Voor inheemse in gel hybridisatie, is het belangrijk om niet het DNA-monster denatureren de hele voorbereiding stappen. Dit kan worden gecontroleerd door het hybridiseren van DNA met telg oligo sonde. Omdat er geen telomeren C-overhang, moet inheemse telg hybridisatie niet toegeven een signaal, tenzij de monsters zijn gedeeltelijk gedenatureerd. De steekproef moet ook gebruikt worden binnen twee weken als de telomeer G-overhang is zeer gevoelig voor elke nuclease activiteit.
Voor adapter ligatie en primer extensie, gezuiverd oligoes opleveren duidelijkere resultaten. Exo T is effectiever dan Exo ik voor het klieven van specifieke enkelstrengs 3 'overhang DNA. Gelijke belasting van de gegloeide monsters zijn essentieel voor de kwantificering van het totale bedrag van de telomeren G-overhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Dr Carolyn Price bedanken voor de wetenschappelijke discussies en inzichtelijke suggesties. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie AI066095 (PI: Bibo Li).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza Inc. | 50004 | |
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Group | 03 115801001 | |
| Exo I | New England Biolabs | M0293 | |
| Exo T | New England Biolabs | M0265 | |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
