Summary
该视频显示与后续分析使用微图案的表面蛋白质相互作用的实验。该方法提供了检测在活细胞内蛋白质相互作用的可能性，并结合在一起的可能性高吞吐能力，提取定量信息。
Abstract
揭开分子间的相互作用网络
Protocol
微接触印刷：
- 切出的微型图象领域的PDMS邮票使用手术刀
- 用乙醇（100％）和蒸馏水冲洗，洗净的字段，其中包含的微型图象。
- 干燥氮气或氩气的PDMS邮票。
- 移液器50μL牛血清白蛋白- Cy5的工作解决方案，使整个微型图象领域的解决方案覆盖到PDMS印花税（0.67毫克/毫升）。孵育30分钟在室温。
- 缓冲液（PBS）和蒸馏水洗净，用磷酸盐冲洗微型图象领域。
- 干燥氮气或氩气的PDMS。
- 根据其自身的重量放置到一个环氧涂层的盖玻片中的PDMS邮票和孵育30分钟室温在培养皿。
- 盖玻片的背面标签上的PDMS邮票的位置，并从幻灯片用钳的邮票地带。
- 坚持在盖玻片上的微接触印刷领域的一个安全的密封杂交腔。标签帮助本地化领域的中心。
- 移液器60μL链霉亲和工作的解决方案（50微克/毫升），进入反应室和孵化样品在室温下60分钟。
- 用1 ml PBS清洗样品，加入到一室的端口的缓冲区，并在用泵的第二个端口同时删除。
- 移液器60μL生物素化抗体工作液（10微克/毫升与0.1％吐温20的PBS补充“; PBST”）进入反应室，并在室温下60分钟的孵育。
- 加入到一室的端口的缓冲区，并再次清除它与泵的第二个端口，用1 ml PBST和随后1毫升PBS清洗样品。
- 在室温避光储存在PBS的micropatterned表面，直至细胞播种准备。
孵化到micropatterned表面的细胞：
- 贴壁细胞生长至50％在3厘米的组织培养板汇合。
- 分离细胞表达利益诱饵和猎物的蛋白质与乙二胺四乙酸（EDTA）的解决方案，并在1000转离心5分钟。
- 弃上清，并根据生长介质中的溶解细胞沉淀。
- 在1000转离心5分钟。
- 弃上清，并在适当的培养液溶解细胞沉淀。
- 交易所从60μL的细胞悬液micropatterned盖玻片上的反应室的PBS。
- 浸泡在蒸馏水中的无菌垫，放入培养皿中干燥运行，以防止样品创建一个湿盒。
- 过夜的细胞在37 °彗星在5％的CO 2 micropatterned表面的气氛。
- 分析细胞在显微镜前，中期交换汉克小号缓冲输入盐溶液， 包括CA 2 +，Mg 2 +的。
显微镜：
- 盖玻片放置在一个合适的贴装和检查细胞形态下的白光。
- 在647 nm处激发的牛血清白蛋白- Cy5的模式的质量检查。
- 记录在488或514 nm的全内反射（TIR）激发下的荧光猎物蛋白（GFP或YFP）的微图案。
代表性的成果：
如果有在上micropatterned表面细胞生长的靶蛋白之间的相互作用，猎物将按照诱饵再分配。微型图象可以被可视化的猎物蛋白的荧光标记。重要的是取得的对比提供了一个直接的措施，相互作用的强度（见图1）。因此，两种蛋白质的相互作用的简单评价成为可能 - 没有必要进一步处理测得的原始数据。
图1。饵料在活细胞质膜在不同的互动优势的重排。 TIR图像（一）CD71 - GFP转染T24细胞上的CD71抗体，（B）的CD4和CD4抗体胞浆YFP和CD59抗体microbiochips（C）的GPI - GFP - DAF所示。数据特征为强（A），无（b）或弱相互作用（C）。 （一）转载（Weghuber 等 ，出版中），（二）（Schwarzenbacher 等 ，2008）。
Discussion
附带的视频演示了用于检测活细胞质膜（Schwarzenbacher 等 ，2008; Brameshuber 等 ，2009; Weghuber 等 ， 出版中 ）的蛋白质-蛋白质相互作用的方法。原则，任何TIRF显微镜平台可用于读出系统。只有当需要高灵敏度的（例如，单分子探测），将需要先进的显微镜。为达到最佳效果，在编写过程中的下列关键点需要特别注意的：
- 商店Cy5的股票黑暗条件下的解决方案，以避免在荧光漂白和新鲜的微接触印刷前的准备BSA - Cy5的工作解决方案。
- 小心划伤的PDMS微型图象枪头孵育样品，在黑暗的条件下，避免了荧光漂白。
- 放在无菌垫，以防止载玻片坚持培养皿中的盖玻片。一旦PDMS邮票坚持载玻片，不要移动它。
- 避免在反应室中的气泡，并在黑暗的条件下，避免了荧光漂白孵化样品。
- 不要超过2分钟，让样品干燥，避免形成的盐晶体。
- 支队的细胞不使用胰蛋白酶切割到目前为止表达的膜蛋白的胞外域。避免胰蛋白酶，将有助于形成微图案的表面上的细胞附着后立即与低周转率的蛋白质。
- 在显微镜控制培养细胞的数量，并确保细胞，没有达到超过30-50％汇合。确保立即删除，过度的细胞由于细胞抗体涂层表面快速接头。
- 只有高品质的牛血清白蛋白- Cy5的模式幻灯片，可用于进一步的分析。
- 稳定表达的荧光猎物蛋白是最好，因为更大，可每次扫描分析细胞数量。
- 足够的TIRF调整是必不可少的，可视化模式，由于胞质背景。
微图形技术提供的蛋白质相互作用的分析了几种可能性。首先，伴随着地方，空间分辨的蛋白质 - 蛋白质相互作用的定量检测弱或间接的相互作用可能没有给予大量的误报或底片的缺点。其次，它使研究人员分析的活细胞质膜，这是难以实现通过生物化学方法，如2个杂交屏幕的蛋白 - 蛋白相互作用。第三，方法允许为诱饵捕食的相互作用，环境的变化，如温度，不同的蛋白质或其他分子或翻译后修饰的存在调制检测。因此，实验可以在活细胞中的相互作用对筛选调制。此外，通过减少捕获配体或使用单价配体的表面密度，静止状态的分析成为可能。最后，如果有足够的扫描平台，分析细胞的数量是不够高，与制药公司的高通量药物筛选的要求（2005年Ramm，）。
Disclosures
视频包含的可视化研究实验室的网页采取奥林巴斯，美国布朗大学提供或（Kim 等人，2003年）转载的图像。
Acknowledgments
我们想感谢她的帮助，卡塔琳娜Strub，瑞士日内瓦大学，奥地利林茨大学，Quentina比蒂，hCD71 - GFP的构建，和丹尼尔Legler，康斯坦茨大学，瑞士GPI - GFP， - DAF的构造。这项工作是由奥地利科学基金会（FWF项目Y250 - B03）和奥地利联邦科学与研究部的创盟项目支持。
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
