Summary
Это видео показывает эксперименты с последующим анализом белок-белковых взаимодействий с помощью микро-узорной поверхности. Подход дает возможность выявления белковых взаимодействий в живых клетках и сочетает в себе высокую производительность с возможностями возможность извлечения количественной информации.
Abstract
Распутывание сетевого взаимодействия молекул
Protocol
Микроконтактной печати:
- Вырежьте области micropattern марки PDMS с помощью скальпеля
- Вымойте поле, содержащее micropattern, смывая его с этанолом (100%) и дистиллированную воду.
- Сухой штамп PDMS с азотом или аргоном.
- 50 мкл BSA-Cy5 рабочего раствора (0,67 мг / мл) на печать PDMS так, чтобы все поле micropattern покрыта раствором. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Вымойте micropattern поле, смывая его с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) и дистиллированную воду.
- Сухой PDMS с азотом или аргоном.
- Место штампа PDMS под действием собственного веса на середине одной эпоксидным покрытием покровное и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в чашке Петри.
- Этикетка положение штампа PDMS на обратной стороне покровного стекла и полосы штамп слайд с щипцами.
- Придерживайтесь Безопасные камеры Гибридизация печать по микроконтактной отпечатанных поля на покровное. Этикетка помогает локализовать центр поля.
- Внесите 60 мкл раствора стрептавидин работы (50 мкг / мл) в реакционную камеру и инкубировать образца в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Вымойте образца с 1 мл PBS, добавив буфер в один порт камеры и удаления его одновременно на второй порт с помощью насоса.
- Внесите 60 мкл биотинилированного решение работать антител (10 мкг / мл в PBS дополнена 0,1% Твин-20 "; PBST") в реакционную камеру и инкубировать в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Вымойте образца с 1 мл PBST, а затем 1 мл PBS путем добавления буфера в один порт камеры и удаления его снова на второй порт с помощью насоса.
- Магазин micropatterned поверхностей в PBS в темноте при комнатной температуре до клетки готовы к посевной.
Инкубация клеток на поверхности micropatterned:
- Расти прилипшие клетки до 50% слияния в 3 см планшета для культуры ткани.
- Отсоедините клеток, экспрессирующих приманку и добычу белки, представляющие интерес с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) решение и центрифуги 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
- Удалите супернатант и растворить осадок клеток в соответствии ростовой среды.
- Центрифуга 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
- Удалите супернатант и растворить осадок клеток в соответствующей среде роста.
- Биржа PBS из реакционной камеры на micropatterned покровное на 60 мкл клеточной суспензии.
- Создать влажной камере путем замачивания стерильной площадку в дистиллированной воде и положить его в чашке Петри, чтобы предотвратить образца от сухого хода.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы на micropatterned поверхностей.
- Прежде чем анализировать клетки под микроскопом, обмен среды буфер солевом растворе Хэнка с, включая Ca 2 + и Mg 2 +.
Микроскопия:
- Покровное делается на подходящую гору и морфологии клеток проверяется при белом свете.
- Качество BSA-Cy5 модели проверяется возбуждения при 647 нм.
- Micropatterns флуоресцентного белка добычу (GFP или YFP), отражаются на 488 или 514 нм при полного внутреннего отражения (ПВО) возбуждения.
Представитель результаты:
Если есть взаимодействие между целевых белков в клетках, выращенных на micropatterned поверхности, добыча будет следовать приманка перераспределения. В результате micropattern могут быть визуализированы флуоресценции метки добычу белка. Важно отличие получены обеспечивает прямое измерение силы взаимодействия (см. Рисунок 1). Поэтому простая оценка взаимодействия двух белков становится возможным - без необходимости дальнейшей обработки измеренных первичных данных.
Рисунок 1. Перестройка приманку в живых плазматической мембране ячейки на различные сильные взаимодействия. МДП изображений клеток Т24 трансфицированных () CD71-GFP на CD71-антитело, (б) CD4 и цитозольного YFP на CD4-антитела и (с) GPI-GFP-DAF на CD59-антитела microbiochips показаны. Данные характерны для сильных (а), нет (б) или слабого взаимодействия (с). () Воспроизводится из (Weghuber и соавт., В печати), (б) из (Schwarzenbacher и соавт., 2008).
Discussion
Сопровождающее видео демонстрирует метод обнаружения белок-белковых взаимодействий в плазме мембраны живых клеток (Schwarzenbacher и др., 2008;. Brameshuber и др., 2009;.. Weghuber и др., в печати). В принципе, любой TIRF-микроскопии платформа может быть использована в качестве считывания системой. Только тогда, когда высокая чувствительность нужен (например, для детектирования единичных молекул), передовые микроскопы не потребуется. Для достижения наилучших результатов следующих критических точек в процессе подготовки требуют особого внимания:
- Магазин Cy5-маточного раствора в темных условиях, чтобы избежать отбеливания флуорофора и подготовить BSA-Cy5 рабочего раствора свеже до микроконтактной печати.
- Будьте осторожны, чтобы не поцарапать micropattern на PDMS с кончика пипетки и инкубировать образца в темных условиях, чтобы избежать отбеливания флуорофора.
- Положите на покровное стерильной площадку для предотвращения прилипания к стеклу чашке Петри. Как только штамп PDMS присоединилась к стеклу, не двигайте его.
- Избегайте пузырьков воздуха в реакционную камеру и инкубировать образца в темных условиях, чтобы избежать отбеливания флуорофора.
- Не позволяйте образец сухой в течение более 2 минут, чтобы избежать образования кристаллов соли.
- Для отряд клетки не используют трипсин как он будет расщеплять внеклеточный домен до сих пор выражается мембранных белков. Как избежать трипсина будут полезны для белков с низкой текучестью кадров для формирования micropatterns сразу же после прикрепления клеток на поверхности.
- Контроль количества инкубировали клетки в микроскоп и убедитесь, что клетки не достигают более 30-50% слияния. Убедитесь в том, что чрезмерное клетки удаляются сразу из-за быстрого прикрепления клеток на покрытых антителами поверхности.
- Только слайды с высоким качеством BSA-Cy5 шаблоны могут быть использованы для дальнейшего анализа.
- Стабильная экспрессия флуоресцентного белка добычу предпочтительнее из-за большего числа клеток, которые могут быть проанализированы на сканирование.
- Адекватная настройка TIRF необходима для визуализации моделей из-за цитозольного фоне.
Микро-паттерна техника предлагает несколько возможностей для анализа белок-белковых взаимодействий. Во-первых, наряду с количественной оценке местных, пространственным разрешением белок-белковых взаимодействий также выявление слабых или косвенное взаимодействие невозможно без недостатков предоставления большого количества ложных срабатываний или негативов. Во-вторых, позволяет исследователю проанализировать белок-белковых взаимодействий в плазме мембраны живых клеток, которые трудно достичь, биохимические подходы, такие как 2-гибридный экран. В-третьих подход позволяет обнаружение приманки-жертва взаимодействия, которые модулируются изменения окружающей среды, как температура, наличие различных белков или других молекул или пост-трансляционной модификации. Таким образом, анализ позволяет для скрининга модуляторы данное взаимодействие пары в контексте живых клеток. Кроме того, за счет уменьшения поверхностной плотности лиганда захвата или использования моновалентной лигандами, анализ состояния покоя становится возможным. Наконец, если адекватные сканирования платформ используются, число анализируемых клетках достаточно высок, чтобы соответствовать высоким требованиям пропускной способности фармацевтических компаний для скрининга препаратов (Рамм, 2005).
Disclosures
Видео содержит изображения, которые были предоставлены Олимп, взятые из домашней странице Лаборатории исследований визуализации, Университет Брауна и воспроизводиться из (Kim и соавт., 2003).
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Quentina Битти, Университет Линц, Австрия, за ее рода помощь, Катарина Strub, Женевский университет, Швейцария, для hCD71-GFP построить, и Даниэль Леглер, университет города Констанц, Швейцария, для GPI-GFP DAF-конструкт. Эта работа была поддержана австрийским фондом науки (ПВ; проект Y250-B03) и GEN-AU проекту австрийского федерального министерства по науке и исследованиям.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
