Summary
이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.
Abstract
분자의 상호 작용 네트워크를 무너지고있다
Protocol
Microcontact 인쇄 :
- 메스를 사용하여 PDMS 스탬프의 micropattern 분야를 잘라
- 에탄올 (100 %)와 증류수로 플러싱하여 micropattern가 들어있는 필드를 씻으십시오.
- 질소 또는 아르곤 가스와 PDMS 스탬프를 건조시킵니다.
- 피펫 50 μl BSA - Cy5 작업 솔루션 (0.67 MG / ML) 전체 micropattern 필드 솔루션으로 덮여있다 있도록 PDMS 스탬프로. 실온에서 30 분 알을 품다.
- 인산과 플러싱하여 micropattern 필드를 세차 살린 (PBS)와 증류수를 버퍼.
- 질소 또는 아르곤 가스와 PDMS를 건조시킵니다.
- 한 에폭시 코팅 coverslip의 중간에 자체 무게에 따라 PDMS 스탬프를 놓고는 배양 접시에 실온에서 30 분 알을 품다.
- coverslip의 뒷면에있는 PDMS 스탬프의 위치를 분류하고 집게로 슬라이드에서 우표를 스트립.
- coverslip에 microcontact - 인쇄 분야를 통해 안전한 인감 하이브 리다이 제이션 실 스틱. 레이블이 분야의 중심을 집중하는 데 도움이됩니다.
- 피펫 60 μl streptavidin 작업 반응 챔버에 솔루션 (50 μg / ML)과 실온에서 60 분에 대한 샘플을 품어.
- 챔버 중 하나 포트에 버퍼를 추가하고 펌프와 두 번째 포트에서 동시에 그것을 제거하여 한 ML PBS로 샘플을 씻으십시오.
- 피펫 60 μl biotinylated 항체 작업 솔루션 (10 μg / 0.1 % 트윈 20과 보충 PBS의 ML, "PBST") 실온에서 60 분 반응 챔버 및 부화에.
- 챔버 중 하나 포트에 버퍼를 추가하고 펌프와 두 번째 포트에서 다시 제거하여 한 ML PBST하고 이후 1 ML PBS로 샘플을 씻으십시오.
- 세포 시딩 준비가 될 때까지 상온에서 어둠의 PBS에서 micropatterned 표면을 저장합니다.
micropatterned 표면에 세포의 인큐베이션 :
- 3cm 조직 문화 판의 50 % 합류로 자기편 세포를 성장.
- Ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션으로 관심을 유인 먹이 단백질을 표현하는 세포를 분리하고 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 따라 성장 매체에있는 세포 펠렛을 디졸브.
- 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 적절한 성장 매체 세포 펠렛을 디졸브.
- 교환 세포 현탁액의 60 μl로 micropatterned coverslip에 반응 챔버에서 PBS.
- 증류수에 살균 패드를 몸으로 건조 실행 예제를 방지하기 위해 페트리 접시에 그것을 넣어 humidified 챔버를 만듭니다.
- 37 박 이상의 세포를 품어 ° micropatterned 표면에 5 % CO 2 분위기에서 C.
- 현미경에서 세포를 분석하기 전에, CA 2 포함한 행크의 버퍼 소금 솔루션으로 매체를 교환 +와 MG 2 +.
현미경 :
- coverslip는 적절한 마운트에 위치하고 세포 형태는 흰 빛 아래에서 확인합니다.
- BSA - Cy5 패턴의 품질은 647 nm의 여기에 의해 확인됩니다.
- 형광 먹이 단백질 (GFP 또는 YFP)의 Micropatterns는 총 내부 반사 (티르) 여기에 따라 488 또는 514 nm의에 기록됩니다.
대표 결과 :
micropatterned 표면에 성장 세포에있는 대상 단백질 간의 상호 작용이있는 경우, 먹이가 미끼 재배포를 수행합니다. 결과 micropattern는 먹이 단백질의 형광 레이블로 시각 수 있습니다. 중요한 얻은 대비 상호 작용의 강도를 직접 측정을 (그림 1 참조)을 제공합니다. 두 단백질의 상호 작용에 따라서 간단한 평가는 가능한 것입니다 - 자세한 측정 기본 데이터를 처리하는 데 필요하지 않고.
그림 1. 다른 상호 작용의 강점에서 라이브 셀 플라즈마 막의 미끼에 다시 정리하기. CD59 - 항체 microbiochips에 티르의 CD71 - 항체에 (A) CD71 - GFP와 transfected T24 세포의 이미지, (B) CD4와 CD4 - 항체에 cytosolic YFP 그리고 (c) GPI - GFP - DAF가 표시됩니다. 데이터에 대한 특성없는 강한 (A),도 (B) 또는 약한 상호 작용 (C). (A) (Weghuber 외., 언론), (B) (Schwarzenbacher 외., 2008)로부터 재현됩니다.
Discussion
함께 비디오 생활 세포의 플라즈마 - 멤브레인 (.; Brameshuber 외, 2009;.. Weghuber 외, 언론에서 Schwarzenbacher 외, 2008)에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 방법을 보여줍니다. 원칙적으로, 모든 TIRF 기반 현미경 플랫폼은 판독 시스템으로 사용할 수 있습니다. 높은 감도 (단일 분자의 검출에 대한 예) 원하는 경우에만, 고급 현미경이 필요합니다. 최상의 결과가 준비 과정에서 다음과 같은 중요한 사항을 달성하기 위해서는 특별한주의가 필요합니다 :
- 어두운 조건 스토어 Cy5 주식 솔루션은 형광단의 표백 방지와 microcontact 인쇄하기 전에 신선한 BSA - Cy5 작업 솔루션을 준비합니다.
- 피펫 팁로 PDMS에 micropattern을 긁거나 형광단의 표백 피하기 위해 어두운 조건에서 샘플을 부화하지 않도록주의하십시오.
- 페트리 접시에 유리 슬라이드의 고집 방지하기 위해 멸균 패드에 coverslip 놔. PDMS 스탬프는 유리 슬라이드에 준수되면, 그것을 이동하지 않습니다.
- 반응 챔버에서 공기 방울을 피하고 형광단의 표백 피하기 위해 어두운 조건에서 샘플을 품어.
- 소금 결정의 형성을 피하기 위해 2 개 이상 분 샘플 건조시키지 마십시오.
- 세포의 분리에 관해서는 트립신을 사용하지 않는 그것 클리브은 지금까지 표현 막 단백질의 세포외 도메인 것입니다. 트립신을 피하기 것은 바로 표면에 세포 부착 후 micropatterns을 형성 낮은 회전율 속도로 단백질을 위해 도움이 될 것입니다.
- 현미경에 incubated 세포의 수를 제어하고 세포가 이상 30-50%의 합류에 도달하지 않은지 확인하십시오. 과도한 세포 인해 항체 - 코팅 표면에 세포의 빠른 첨부 파일에 즉시 제거되었는지 확인합니다.
- 고품질 BSA - Cy5 패턴만을 슬라이드가 추가 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
- 형광 먹이 단백질의 안정적인 표현으로 인해 스캔마다 분석할 수 세포의 더 많은 것이 바람직합니다.
- 적절한 TIRF 조정은 cytosolic 배경으로 인해 패턴을 시각화하기 위해 필수입니다.
마이크로 patterning 기술은 단백질 - 단백질 상호 작용의 분석을위한 몇 가지 가능성을 제공합니다. 첫째, 지역, 공간 해결 단백질 단백질 상호 작용의 부량와 함께 또한 약한 또는 간접적으로 상호 작용의 검출은 잘못된 반응 또는 제외 높은 번호를 부여의 단점없이 가능합니다. 둘째 그것은 2 하이브리드 화면과 같은 생화 학적 방법에 의해 달성하기 어렵습니다 라이브 세포의 플라즈마 막에 단백질 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 연구자 수 있습니다. 셋째 방법은 온도, 다른 단백질이나 다른 분자 또는 사후 translational 수정의 존재와 같은 환경 변화에 의해 변조된 아르 미끼 - 먹이 상호 작용의 검출을 허용합니다. 따라서 분석 살 세포의 맥락에서 주어진 상호 작용 쌍 심사 변조기를 허용합니다. 또한 캡처 리간드 또는 monovalent 리간드의 사용의 표면 밀도를 줄임으로써, 휴식 상태의 분석이 가능하게됩니다. 적절한 검색 플랫폼을 사용하는 경우 마지막으로, 분석 세포의 숫자는 약물 검사를위한 제약 회사의 높은 처리량 요구 (램, 2005)와 일치 정도로 높습니다.
Disclosures
비디오 시각화 연구실의 홈페이지에서 가져온 올림푸스, 브라운 대학에 의해 제공 또는 (김 외., 2003)에서 재현되었습니다 이미지가 포함되어 있습니다.
Acknowledgments
우리는 GPI - GFP 들어, hCD71 - GFP 구축, 그리고 다니엘 레글러, 콘스탄츠, 스위스의 대학에 대한 그녀의 친절한 도움 Katharina Strub, 스위스 제네바 대학에 대한 Quentina 비티, 린츠, 오스트리아의 대학, 감사의 말씀을 전합니다 - DAF는 건설. 과학 연구에 대한 오스트리아 연방 교육부의 GEN - AU 프로젝트,이 작품은 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 Y250 - B03 FWF)에 의해 지원되었다.
References
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- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
