Summary
هذا الفيديو يبين تحليل التجارب مع لاحقة من البروتين البروتين التفاعلات عن طريق استخدام الصغرى منقوشة السطوح. النهج توفر إمكانية الكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية ، ويجمع بين قدرات إنتاجية عالية مع إمكانية استخراج المعلومات الكمية.
Abstract
تفكيك شبكة تفاعل الجزيئات
Protocol
Microcontact الطبعة :
- قطع ميدان micropattern من الطوابع PDMS باستخدام مشرط
- غسل الحقل الذي يحتوي على micropattern بواسطة بيغ مع الإيثانول (100 ٪) والماء المقطر.
- جافة الطابع PDMS مع النيتروجين أو غاز الارجون.
- ماصة 50 ميكرولتر BSA - Cy5 الحل العمل (0.67 ملغ / مل) على الطابع PDMS بحيث يتم تغطية ميدانية micropattern كله مع الحل. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- التخزين المؤقت غسل مجال micropattern بواسطة بيغ مع المؤسسة العامة لتحلية الفوسفات (PBS) والماء المقطر.
- تجفيف PDMS مع النيتروجين أو غاز الأرجون.
- وضع ختم PDMS تحت وزنه على منتصف ساترة الايبوكسي المغلفة واحدة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في طبق بتري.
- التسمية موقف الطابع PDMS على مساعدات من ساترة والشريط الطابع من الشريحة مع ملقط.
- عصا تهجين ختم الغرفة الآمنة على الحقل microcontact المطبوعة على ساترة. التسمية يساعد على توطين وسط الميدان.
- 60 ماصة العمل streptavidin ميكرولتر حل (50 ميكروغرام / مل) إلى دائرة رد الفعل واحتضان العينة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل العينة مع PBS 1 مل بإضافة العازلة إلى منفذ واحد للغرفة وإزالته في وقت واحد في الميناء الثاني مع مضخة.
- ماصة 60 ميكرولتر العمل الضد biotinylated حل (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.1 ٪ توين 20 ؛ "PBST") في دائرة رد الفعل واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل العينة مع PBST مل 1 و 1 في وقت لاحق PBS مل بإضافة العازلة إلى منفذ واحد للغرفة وإزالته مرة أخرى في الميناء الثاني مع مضخة.
- تخزين الأسطح micropatterned في برنامج تلفزيوني في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى تكون جاهزة للخلايا البذر.
حضانة الخلايا على سطح micropatterned :
- تنمو الخلايا تمسكا التقاء 50 ٪ في لوحة سم 3 زراعة الأنسجة.
- فصل الخلايا معربا عن الطعم والبروتينات فريسة المصالح مع Ethylenediaminetetraacetic الحل (EDTA) وحامض 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي 1000 دورة في الدقيقة.
- تجاهل طاف بيليه وحل الخلية في النمو على المديين المتوسط وفقا.
- 5 دقائق في جهاز الطرد المركزي 1000 دورة في الدقيقة.
- تجاهل طاف وحل بيليه خلية في المتوسط النمو المناسبة.
- تبادل PBS من دائرة رد الفعل على ساترة micropatterned بنسبة 60 ميكرولتر من التعليق الخلية.
- إنشاء غرفة ترطيب التي تمرغ لوحة معقم في الماء المقطر ووضعه في طبق بتري لمنع العينة من تشغيل جافا.
- احتضان خلايا أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2 على السطوح micropatterned.
- قبل تحليل الخلايا على المجهر ، وتبادل والمتوسطة من خلال حل هانك ق الملح مخزنة بما كا 2 + 2 + والمغنيسيوم.
المجهر :
- ساترة يوضع على جبل المناسبة ويتم فحص خلية التشكل تحت الضوء الأبيض.
- يتم فحص جودة أنماط - BSA Cy5 بواسطة الإثارة في 647 نانومتر.
- وتسجل Micropatterns فريسة للبروتين فلوري (GFP أو YFP) في 488 أو 514 نانومتر تحت إجمالي الداخلية الإثارة (TIR) التأمل.
ممثل النتائج :
إذا كان هناك تفاعل بين البروتينات في الخلايا المستهدفة نمت على سطح micropatterned ، سوف تتبع فريسة إعادة توزيع الطعم. يمكن تصور أن يكون micropattern الناتجة عن تسمية مضان من البروتين الفريسة. الأهم الحصول على النقيض يوفر مقياسا مباشرا لقوة التفاعل (انظر الشكل 1). لذا فإن تقييم بسيطة من التفاعل من اثنين من البروتينات يصبح من الممكن -- دون الحاجة إلى مزيد من عملية قياس البيانات الأولية.
الشكل 1. إعادة ترتيب الطعم في غشاء الخلية الحية على القوة البلازما تفاعل مختلفة. وتظهر الصور TIR الخلايا T24 transfected مع (أ) CD71 - GFP على الأجسام المضادة CD71 ، CD4 (ب) و YFP عصاري خلوي على الأجسام المضادة CD4 و (ج) GPI - GFP DAF - CD59 على الضد microbiochips. البيانات هي سمة مميزة لقوي (أ) ، لا (ب) أو التفاعل الضعيف (ج). (أ) يرد من (Weghuber آخرون ، في الصحافة) و (ب) من (Schwarzenbacher وآخرون ، 2008).
Discussion
شريط الفيديو المرافق يوضح طريقة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية (Schwarzenbacher وآخرون ، 2008 ؛. Brameshuber وآخرون ، 2009 ؛. Weghuber وآخرون ، تحت الطبع). من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أي منصة المجهري TIRF القائم على نظام قراءات. فقط عندما يتم المطلوب حساسية عالية (على سبيل المثال للكشف عن الجزيئات واحد) ، سيكون مطلوبا المجاهر المتقدمة. لتحقيق أفضل النتائج على النقاط الهامة التالية أثناء عملية الإعداد تتطلب اهتماما خاصا :
- Cy5 تخزين مخزون حل في ظل الظروف المظلمة لتجنب التبييض من fluorophore وإعداد جيش صرب البوسنة ، حل Cy5 العمل الطازج قبل الطباعة microcontact.
- يجب الحرص على عدم خدش micropattern على PDMS مع طرف ماصة واحتضان العينة تحت الظروف المظلمة لتجنب التبييض من fluorophore.
- وضع على لوحة ساترة معقمة لمنع الالتصاق من الشريحة الزجاجية لطبق بتري. مرة واحدة الطابع PDMS انضمت إلى الشريحة الزجاجية ، لا نقله.
- تجنب فقاعات الهواء في دائرة رد الفعل واحتضان العينة تحت الظروف المظلمة لتجنب التبييض من fluorophore.
- لا تدع العينة الجافة لأكثر من 2 دقيقة لتجنب تشكيل بلورات الملح.
- لمفرزة من خلايا لا تستخدم التربسين لأنها سوف يلتصق المجال خارج الخلية من بروتينات الغشاء حتى الآن التعبير عنها. وسوف يكون من المفيد تجنب التربسين للبروتينات مع معدل دوران منخفض لتشكيل micropatterns مباشرة بعد الحجز على الخلايا على السطح.
- السيطرة على عدد من الخلايا المحتضنة في المجهر والتأكد من أن الخلايا لا تصل إلى أكثر من 30-50 ٪ التقاء. تأكد من أن تتم إزالة الخلايا المفرط على الفور نظرا لارتباط سريع للخلايا على سطح جسم المغلفة.
- ويمكن استخدام الشرائح فقط مع أنماط جودة عالية Cy5 جيش صرب البوسنة لمزيد من التحليل.
- التعبير المستقرة للبروتين فلوري فريسة هو الأفضل نظرا لعدد أكبر من الخلايا التي يمكن تحليلها في الفحص.
- أمر لا غنى عنه TIRF كافية لتصور أنماط التكيف بسبب الخلفية عصاري خلوي.
تقنية الزخرفة الدقيقة فرصا عدة لتحليل البروتين البروتين التفاعلات. أولا ، مع تقدير المحلية ، وتفاعلات البروتين البروتين حل مكانيا أيضا في الكشف عن التفاعلات الضعيفة أو غير المباشرة ممكنة بدون عيوب إعطاء عدد كبير من ايجابيات كاذبة أو السلبيات. وثانيا أنها تمكن الباحث لتحليل التفاعلات بين البروتينات والبروتين في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، والتي من الصعب تحقيقه من خلال نهج البيوكيميائية مثل الشاشة 2 - الهجين. ثالثا النهج يسمح للكشف عن الطعم والفريسة التفاعلات التي يتم عن طريق التضمين التغيرات البيئية مثل درجة الحرارة ، وجود جزيئات البروتينات المختلفة أو غيرها أو التعديلات بعد متعدية. وبالتالي يسمح للمقايسة جهري الفرز من زوج التفاعل المعطى في سياق الخلايا الحية. علاوة على ذلك ، عن طريق الحد من كثافة سطح يجند التقاط أو استخدام يغاندس الأحادي التكافؤ ، وتحليل لحالة الراحة يصبح ذلك ممكنا. أخيرا ، إذا كنت تستخدم منصات كافية المسح الضوئي ، وعدد الخلايا تحليل مرتفع بما يكفي لمواكبة متطلبات إنتاجية عالية من شركات الأدوية لفحص المخدرات (رم ، 2005).
Disclosures
شريط فيديو يحتوي على الصور التي تم توفيرها من قبل أوليمبوس ، مأخوذة من موقع التصوير للمختبر البحوث ، جامعة براون أو مستنسخة من (كيم وآخرون ، 2003).
Acknowledgments
نود أن نشكر Quentina بيتي ، جامعة لينز ، النمسا ، للحصول على مساعدة عينية لها ، كاتارينا Strub ، جامعة جنيف ، سويسرا ، من أجل بناء hCD71 - GFP ، ودانيال Legler ، جامعة كونستانس ، سويسرا ، لGPI - GFP DAF ، بناء. وأيد هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF ؛ المشروع Y250 - B03) ومشروع الاتحاد الأفريقي لGEN - الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والبحوث.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
