Количественный ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) является эффективным инструментом для диагностики мРНК в разных тканях насекомого и стадии развития. В этом отчете мы показываем использование QRT-PCR установить уровни мРНК в разных тканей личинки и стадии развития инвазивных видов насекомых, изумруд золы буром.
Abstract
Изумрудный золы буром (EAB,<em> Agrilus planipennis</em>) Является экзотических инвазивных вредителями, который убил миллионы ясень (<em> Fraxinus</em> SPP) в Северной Америке.<strong></strong> EAB продолжает быстро распространяться и нападения золы деревьев разных возрастов, от саженцев до взрослых деревьев. Однако на сегодняшний день очень мало или вообще не знание молекулярной существует для EAB. Мы заинтересованы в расшифровке молекулярной основе физиологических процессов на тканевом уровне, что помощь EAB в успешной колонизации ясень. В этом отчете мы показываем эффективного использования количественного ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) для определения уровня мРНК в разных личиночных тканей (в том числе средней кишки, жир тела и кутикулой) и различных стадий развития (в том числе 1<sup> Й</sup> -, 2<sup> Й</sup> -, 3<sup> Й</sup> -, 4<sup> Й</sup>-Возрастов, предкуколок и взрослых) из EAB. Например, ген peritrophin (здесь назван,<em> AP-PERI1</em>) Является примером, как ген интереса и рибосомных белков (<em> AP-RP1</em>) В качестве внутреннего контроля. Peritrophins являются важными компонентами мембран перитрофической / матрицы (ПМ), который является прокладка насекомых кишечнике. PM обладает разнообразными функциями, включая пищеварение и механическую защиту, чтобы кишки эпителия.
Protocol
Полный протокол с разными шагами изображена на блок-схеме на рисунке 1. Отдельные этапы, составляющие рассечение, РНК добычи, первой цепи кДНК синтеза и QRT-PCR подробно описаны ниже. И. личинок Dissection До начала этой процедуры, место Изумрудный золы буром или EAB, личинки ?…
Discussion
Порога циклов (Ct) значения, полученные для каждого образца в QRT-PCR пластины. Для приготовления стандартной кривой, значение Ct, полученных для каждого разведения был заговор против журнала его концентрации. Ct значения для экспериментальных образцов были затем построены на этой стандартн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, помощь, оказанную при Лурдес Delta Arrueta Антекера (кафедра энтомологии Университета штата Огайо / OARDC, Вустер, штат Огайо) в настройке экспериментов. Мы благодарим доктора Терезы Польша (USDA, лесных служб, NRS) для отправки EAB личиночной образцов. Помощь при условии, д-р Луис Канас и Nuris М Акоста с микроскопом установки приветствуется. Финансирование этого проекта была оказана со стороны государства и Федеральной средств, ассигнованных в Огайо сельскохозяйственных исследований и развития центра, университета штата Огайо.
Bhandary, B., Rajarapu, S. P., Rivera-Vega, L., Mittapalli, O. Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR. J. Vis. Exp. (39), e1974, doi:10.3791/1974 (2010).