Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr ( Agrilus planipennis) Med kvantitativa realtid-PCR
Summary
Kvantitativa realtids-PCR (QRT-PCR) är ett effektivt verktyg för att diagnostisera mRNA nivåer i olika insekter vävnader och utvecklingsstadier. I denna rapport visar vi att använda QRT-PCR för att fastställa mRNA nivåer i olika larver vävnader och utvecklingsstadier av de invasiva insektsarter, smaragd aska borr.
Abstract
Emerald aska borr (EAB,<em> Agrilus planipennis</em>) Är en exotisk invasiv skadedjur, som har dödat miljontals aska träd (<em> Fraxinus</em> Spp.) i Nordamerika.<strong></strong> EAB fortsätter att spridas snabbt och attacker aska träd i olika åldrar, från sly att mogna träd. Hittills har dock mycket liten eller ingen molekylära kunskapen finns för EAB. Vi är intresserade av att dechiffrera molekylär-baserade fysiologiska processer i vävnaden nivå som stödet EAB i en lyckad kolonisering av aska träd. I denna rapport visar vi en effektiv användning av kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) att se till mRNA nivåer i olika larv vävnader (inklusive midgut, fett organ och nagelband) och olika utvecklingsstadier (inklusive en<sup> St</sup> -, 2<sup> Nd</sup> -, 3<sup> RD</sup> -, 4<sup> Th</sup>-Instars, prepupae och vuxna) i EAB. Som ett exempel, en peritrophin gen (häri namngivna,<em> AP-PERI1</em>) Exemplifieras som genen av intresse och en ribosomala protein (<em> AP-RP1</em>) Som den interna kontrollen. Peritrophins är viktiga komponenter i peritrophic membran / matris (PM), som är slemhinnan i insekt tarmen. PM har olika funktioner, inklusive matsmältning och mekaniskt skydd för midgut epitelet.
Protocol
Discussion
Tröskeln cykler (Ct) värde erhålls för varje prov i QRT-PCR-platta. För att göra standardkurvan, var Ct värde som erhålls för varje spädning plottad mot stocken av sin koncentration. Den Ct-värden för de experimentella späddes sedan ritas in på denna spädningsserie standardkurvan. Mål mängder har beräknats från olika standard kurvor genereras för varje experiment, dvs vävnad och utvecklande uttryck. Den relativa uttrycket värden (varv) var bestäms sedan genom att dividera mängden av målet sekven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner den hjälp som Lourdes Delta Arrueta Antequera (Institutionen för entomologi, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) i installationen av experiment. Vi tackar Dr Therese Polen (USDA, Forest Services, NRS) för skicka EAB larver prover. Hjälp från Dr Luis En Canas och Nuris M Acosta med mikroskop setup är uppskattat. Finansieringen för detta projekt har tillhandahållits av statliga och federala medel anslås till Ohio jordbruksforskning och utveckling Center, Ohio State University.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. . Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).
