סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Summary

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

Abstract

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבות את העובר החולייתנים הראשונים הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. בשנת עוברי דג הזברה, הזרקה של תוצאות ה-DNA פלסמיד בביטוי פסיפס, המאפשר ויזואליזציה של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים

Protocol

1.Microinjection

1. מדולל פלסמיד קידוד קרום במיקוד גרין פלורסנט חלבון (mGFP, באדיבות ריצ'רד הרלנד) כדי בריכוז של 40 ng / ml. DNA הוא הוכן על ידי linearizing פלסמיד (mGFP/PCS2 +, באדיבות ריצ'רד הרלנד) מטוהרים באמצעות ערכת הכנה Qiagen מקסי. תוספת של פנול אדום (בדילול מלא 1 / 10 הנפח הכולל) לפתרון עדיף לדמיין את הפתרון. שמור את פתרון ה-DNA על הקרח.
2. תחת stereomicroscope, לכייל את מחט הזריקה (90mm זכוכית הנימים מ Narishinge מדעי: חתול מס 'NA-GD-1) על ידי יישור מחט בשקופית סיים בעדינות את החלק הקשה של המחט שבה הקוטר הוא 1μm באמצעות סכין גילוח נקי להב (כדי לקבל קצה בגודל המתאים).
3. על מנת לכייל את המחט להזריק נפח ידוע (2nl), לחבר את המחט למנגנון microinjection (PCI 100 Microinjector; הרווארד Apparatus) ו הקדמי למלא את המחט עם 0.5μl פתרון המכיל מים פנול אדום והניח על פיסת של פרפין. הפתרון ניתן לוותר באמצעות דוושת רגל. הגדר את הלחץ kPa 7 ולגוון את הזמן (10msec 30msec), כך שזה לוקח 250 דוושות לוותר 0.5μl של הפתרון.
4. בזהירות במקום מחט מכויל על רצועה של שעווה צלחת פטרי 100 מ"מ humidified. כדי ללחלח את המנה, המקום Kimwipes רטוב בקצוות (זה מונע אידוי של הפתרון את המחט).
5. השתמש micropipette לטעון 0.5-1μl של דנ"א לתוך קצה המחט (בסוף זה לא היה מכויל).
6. לאחר הפתרון הגיע חוד המחט, חבר את הקצה של המחט אשר שימשה להעמסה על מנגנון microinjection. התאם את ההגדרות על microinjector לספק כ -2 nl / ההזרקה באמצעות דוושת רגל.
7. בשלב הבא, דג הזברה עמדה עוברים באמצע צלחת פטרי מלאות בינונית העובר (צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 1, 0.1 במלאי מ"ל של האנק מס '2, צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 4, 95.9 מ"ל DDH ₂ O, צילומים של 1.0 מ"ל של האנק # 5 , צילומים של 1.0 מ"ל של טרי האנק # 6, השתמש בערך 10 טיפות NaOH M 1 ל-pH 7.2).
8. לאחר העוברים פיתחו לשלב הרצוי, בעדינות אחיזת סיסית עם מלקחיים בסדר למקם את המחט לאזור ממוקד עבור זריקה. עבור ביטוי מגוון רחב mGFP, להזריק DNA בחלמון או בציטופלסמה בשלב 1cell. כדי להגביל את הביטוי של mGFP לאזור קטן יותר, להזריק DNA ב 4 (או יותר) שלב תאים לתוך הציטופלסמה של תא בודד.
9. לחצו על דוושת הרגל של המנגנון microinjection ולספק כ -2 nl, להבטיח כי הפתרון (גלוי בשל תוספת של פנול אדום) מוזרק כהלכה.
10. מוציאים בזהירות את המחט מן העובר.
11. חזור לכל העוברים בצלחת פטרי.
12. אפשר לפתח את העוברים על 28.5 ° C לשלב הרצוי.
13. עוברים Dechorionate ידי בעדינות קילוף סיסית באמצעות מלקחיים קנס (אם עוברים בני פחות מ 24hpf, dechorionating בכלי זכוכית פטרי מעלה את שיעור ההישרדות של עוברים).
14. הסר סיסית ריק מצלחת פטרי בעזרת פיפטה מזכוכית.

2. הדמיה mGFP שכותרתו סעיפים vibratome

1. השתמש פיפטה זכוכית להעביר עוברים לתוך paraformaldehyde (מחזיק 4% פתרון חיץ 1X פוספט (PBS). Fix עוברים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. לשטוף עוברים 1X PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
3. מניחים את העוברים בצלחת פטרי, באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את החלמון מבלי לפגוע בעובר. הסר כמו חלמון האפשר.
4. הכן 4% נמוך להמיס agarose ב H ₂ O.
5. המקום agarose מותכת לתוך תבנית פלסטיק חתך.
6. שימוש במלקחיים בסדר להרים עובר מוזרק מצלחת פטרי למקום לכוון את agarose. העובר צריך להיות ממוצבת לקראת סוף אחד עובש.
7. לאחר agarose הוא מוקשה, להשתמש בכלי משטח שטוח, כגון מרית, כדי להסיר את הבלוק agarose מן התבנית.
8. חותכים את הקצה התחתון של הגוש agarose בסכין גילוח כך שהוא אפילו.
9. הוסף טיפה של דבק סופר לשלב vibratome והמקום לחסום agarose על זה (הצד של גוש זה התייצבה עם סכין הגילוח צריך להתמודד עם דבק). עבור חתך עוברים מרובים, הר agarose-מוטבע מספר דגימות על הבמה.
10. צרף את הבמה vibratome את vibratome (Vibratome, Inc).
11. הגדר את הפרמטרים של vibratome (ההגדרות הנפוצות: מהירות-3, עובי-50μm). אם חתך עוברים מרובים, ליישר בלוקים agarose על הבמה להבטיח כי הלהב עובר לעובר כולו, אך לא דרך רוחב כולו מאבני agarose (כך בסעיפים המתאימים העובר אותו יישארו יחד).
12. יוצקים 1X PBS בשלב vibratome.
13. סעיף.
14. פעם הם עוברים sectioנד, להסיר את הבלוק agarose (ים) משלב vibratome.
15. בזהירות להפריד כל קטע על ידי חיתוך האחורי של לחסום agarose (ים).
16. השתמש מלקחיים קנס כדי לבחור חלקים הרצוי מקום לתוך צלחת PBS מלא רב גם 1X (להשתמש בבארות שונים בסעיפים המתאימים עוברים שונים).
17. חזור על הפעולה עבור כל העובר.
18. המשך עם תיוג נוגדן, 19 צעדים על פי 23, כדי לשפר את mGFP הדמיה (שלב זה לא עשוי להיות נחוץ אם הסעיפים הם צילמו בתוך יום או יומיים של הכנה).
19. פנקו את הסעיפים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת 1X PBS לחסום הלא ספציפית מחייב.
20. סעיפים דגירה עם נוגדן ראשוני (ארנב-GFP, Invitrogen חתול מס 'A11122) מדולל @ 1:200 בפתרון חסימת על שייקר במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
21. לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO.
22. פנקו עם נוגדנים משני חלקים המתאימים פתרון חסימת במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C.
23. לשטוף ארבע פעמים (10 דקות, 15 דקות, 30 דקות ו 60 דקות, כל אחד) 1% BSA/1X PBS / 1% פתרון DMSO.
24. פנקו את החלקים עם DAPI (0.1% ב 50 מ"ל DAPI 1X PBS; Invitrogen חתול מס 'D1306) במשך 30 דקות להכתים את הגרעינים.
25. לשטוף שלוש פעמים 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד.
26. הר בשקופית.
27. תמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

3. חיים הדמיה

1. Dechorionate לחיות, עוברים מוזרק 30 דקות לפני שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. מניחים את העוברים בפתרון הרגעה (0.01% Tricaine ב בינונית העובר) במשך 15 דקות.
2. המקום agarose ירידה של 1% על צלחת זכוכית 35mm התחתונה תרבות (MatTek; מס 'חלק P35G-o-20-C).
3. אפשר agarose לחזק.
4. מחממים על אש צינור נימי לעשות 3 חורים agarose (חפצים אחרים כגון טיפים micropipette ניתן להשתמש כדי לעשות את החורים). ודא כי אין agarose שיורית בתחתית הבור.
5. מלאו את צלחת פטרי עם בינונית העובר.
6. השתמש פיפטה זכוכית למקום העובר בתוך הבור.
7. בשלב הבא, לכוון את העובר באמצעות מלקחיים קנס כך האזור להיות צילמו (ראש הגבי) נמצא בקשר עם הזכוכית.
8. בזהירות התחבורה צלחת פטרי לשלב מיקרוסקופ (במקום המכסה מעל צלחת פטרי כדי למנוע אידוי).
9. בעוד הדמיה, להבטיח כי הם עוברים על 28.5 ° C.

4. תוצאות

אנו מתארים כאן גישה ישירה לתאי תמונה אחת בצינור העצבי דג הזברה באמצעות הביטוי פסיפס. למרות השקיפות האופטי של העובר דג הזברה, מצאנו כי ויזואליזציה של תאים עצביים היא משופרת מאוד חתכים שהושגו באמצעות vibratome. סעיפים אלה עבה (50 מ"מ) המאפשר הדמיה של הרחבה הסלולר מתא נתון מטוסים מוקד שונים באמצעות מיקרוסקופ confocal. תוצאות השימוש במתודולוגיה זו פורסמו ² במקום אחר, אבל נציג תמונות של התאים בצינור העצבי של העובר WT (איור 1) ו - N-cadherin (N-CAD) מוטציה (איור 2) מסופקים. האחרון מגלה כי התאים באזורים לרוחב הצלחת עצבית N-CAD מוטנטים מצליחים להתמצא כראוי כלפי קו האמצע (איור 2). בניגוד תיוג זה פסיפס, immunostaining neuroepithelium עם סמן השטח הכללי תא כגון בטא catenin אינו מאפשר את המורפולוגיה של תאים בודדים להיות דמיינו (איור 3).

זמן לשגות הדמיה של עוברים לחיות השלימו את תיוג פסיפס של דגימות קבוע, דבר המאפשר הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation. סרט 1 גילה כי תאים WT פעיל לנדוד לעבר קו האמצע ידי הרחבת מדיאלית מוכווני בליטות בממברנה.

1. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה WT.

2. איור mGFP ביטוי בצינור העצבי של העובר דג הזברה N-cadherin.

3. איור ב-catenin חיסונית מכתים של neuroepithelium.

Discussion

לסיכום, שיטות תיוג המתוארת כאן לאפשר לניתוח תא בודד של תהליכים המוךפו"גנטי שהולך בעובר דג הזברה. הדגש העיקרי של פרוטוקול זה הוא על שיטות דימות תאים שכותרתו בצינור העצבי באמצעות mGFP בשליטת היזם בכל מקום. עבור יישומים נוספים של הקוראים זה assay חולף ביטוי לעיין במאמר לאחרונה על ידי אנדרסן et al. ^3.

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)