Märkning och celler Imaging i zebrafisk Hindbrain

Summary

Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer som formar det tidiga embryot är förmågan att bilden celler med hög upplösning. Vi beskriver här en teknik för märkning av enskilda celler eller små grupper av celler i hela zebrafisk embryon med membran riktade-grönt fluorescerande protein.

Abstract

Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer som skapar den tidiga ryggradsdjur embryot är förmågan att bilden celler med hög upplösning. I zebrafisk embryon, injektion av plasmid-DNA resulterar i mosaik uttryck, vilket möjliggör visualisering av enskilda celler eller små grupper av celler

Protocol

1.Microinjection

1. Späd plasmid kodning membran riktade grönt fluorescerande protein (mGFP, artighet av Richard Harland) till en koncentration på 40 ng / ml. DNA är utarbetad av linearizing plasmid (mGFP/PCS2 +, artighet av Richard Harland) renas med hjälp av Qiagen Kit Maxi Prep. Tillägg av fenol rött (utspädd 1 / 10 total volym) för att lösningen är att föredra för att visualisera lösningen. Håll DNA lösningen på is.
2. Enligt ett stereomikroskop, kalibrera injektionsnål (90mm glas kapillärer från Narishinge Scientific, Cat No NA-GD-1) genom att rikta nålen på ett graderat bild och försiktigt knacka den del av nålen där diametern är 1μm med en ren rakkniv blad (för att få en spets av lämplig storlek).
3. För att kalibrera nålen att injicera en känd volym (2nl), anslut nålen till mikroinjektion apparater (PCI 100 Microinjector, Harvard apparater) och främre fylla nålen med 0.5μl av en lösning innehållande fenolrött och vatten placeras på en bit av paraffin. Lösningen kan lämnas ut med hjälp av en fotpedal. Ställ in trycket till 7 kPa och varierar tiden (10msec 30msec) så att det tar 250 pedaler att fördela 0.5μl av lösningen.
4. Placera försiktigt kalibrerade nålen på en remsa av vax i en fuktig 100 mm petriskål. Att fukta skålen, lägg blöta Kimwipes runt kanterna (detta förhindrar avdunstning av lösningen i nålen).
5. Använd en mikropipett för att ladda 0.5-1μl av DNA in i kanylen (slutet som inte var kalibrerad).
6. När lösningen har nått nålspetsen, anslut änden av nålen som användes för lastning till en mikroinjektion apparat. Justera inställningarna på microinjector att leverera cirka 2 NL / injektion med en fotpedal.
7. Därefter ställning zebrafisk embryon i mitten av en petriskål fylld med Embryo Medium (1,0 ml Hanks Stock # 1, 0,1 ml Hanks Stock # 2, 1,0 ml Hanks Stock # 4, 95,9 ml DDH ₂ O, 1,0 ml Hanks Stock # 5 , 1,0 ml färsk Hanks Stock # 6, Använd ca 10 droppar 1 M NaOH till pH 7,2).
8. När embryona har utvecklats till den önskade scenen, försiktigt grepp chorion med fin pincett och placera nålen i området riktade för injektion. För brett mGFP uttryck, injicera DNA i äggulan eller cytoplasman i 1cell skede. Om du vill begränsa uttryck för mGFP till en mindre region, injicera DNA i 4 (eller fler) celler skede i cytoplasman av en enda cell.
9. Tryck på fotpedalen av mikroinjektion apparater och levererar ca 2 nl, så att lösningen (synlig på grund av tillägg av fenolrött) är korrekt injiceras.
10. Ta försiktigt bort nålen från embryot.
11. Upprepa för alla embryon i petriskål.
12. Låt embryon att utvecklas i 28,5 ° C till önskad scen.
13. Dechorionate embryon genom att försiktigt skala av det chorion med fin pincett (om embryon är yngre än 24hpf, dechorionating i ett glas petriskål ökar överlevnaden av embryon).
14. Ta bort tomma chorion från petriskål med ett glas pipett.

2. Imaging mGFP-märkta vibratome sektioner

1. Använd en glaspipett att transportera embryon i fixativ (4% paraformaldehyd i 1X fosfatbuffertlösning (PBS). Fix embryon vid 4 ° C över natten.
2. Tvätta embryona i 1X PBS 3 gånger i 5 minuter vardera.
3. Placera embryon i petriskål, med fin pincett, ta ut gulan utan att skada embryot. Ta bort så mycket äggula som möjligt.
4. Förbered 4% låg smälta agaros i H ₂ O.
5. Placera smälta agarosen i plast snittning mögel.
6. Använd fin pincett för att lyfta en injicerade embryo från petriskål och till plats och orientera i agaros. Embryot bör placeras mot ena änden av mögel.
7. När agarosen härdas, använd en plan yta verktyg, t.ex. en spatel, att ta bort agarosen kvarter från mögel.
8. Skär den nedre änden av agaros block med ett rakblad så att det är jämnt.
9. Lägg en droppe superlim på vibratome scenen och placera agarosen blocket på den (den sida av blocket som var planat ut med rakkniv bör möta lim). För sektionering flera embryon, montera flera agaros-inbäddade prover på scenen.
10. Fäst vibratome scenen till vibratome (Vibratome, Inc.).
11. Ställ in parametrar för vibratome (gemensamma inställningar: hastighet-3, tjocklek-50μm). Om sektionering flera embryon, rikta agarosen block på scenen och se till att kniven går igenom hela embryot, men inte genom hela bredd agarosen block (så att avsnitt som motsvarar samma embryo förblir tillsammans).
12. Häll 1X PBS i vibratome skede.
13. Avsnitt.
14. När embryona sectioNed, ta bort agarosen blocket (s) från vibratome scenen.
15. Separera försiktigt varje avsnitt genom att skära på baksidan av agarosen blocket (s).
16. Använd fin pincett för att välja önskat avsnitt och placera i en 1X PBS-fyllda med flera bra skålen (använda olika brunnar för sektioner som motsvarar olika embryon).
17. Upprepa för varje embryo.
18. Fortsätt med antikroppar märkning, steg 19 men 23, för att förbättra mGFP imaging (detta steg är kanske inte nödvändigt om avsnitten är avbildad inom en dag eller två av förberedelser).
19. Behandla sektioner i 30 minuter vid rumstemperatur med blockerande lösningen i 1X PBS att blockera icke-specifik bindning.
20. Inkubera sektioner med primär antikropp (kanin en-GFP, Invitrogen Cat No A11122) utspädd @ 1:200 i blockerande lösningen på en shaker i 5 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
21. Tvätta fyra gånger (10 min, 15 min, 30 min och 60 min, varje) i 1% BSA/1X PBS / 1% DMSO lösning.
22. Behandla sektioner med lämplig sekundär antikropp i blockerande lösningen i 5 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
23. Tvätta fyra gånger (10 min, 15 min, 30 min och 60 min, varje) i 1% BSA/1X PBS / 1% DMSO lösning.
24. Behandla sektioner med DAPI (0,1% DAPI i 50 ml 1X PBS, Invitrogen Cat No D1306) i 30 minuter att färga kärnor.
25. Tvätta tre gånger i 1X PBS i 5 minuter vardera.
26. Montera på bild.
27. Bilden med konfokalmikroskopi.

3. Bildproduktion

1. Dechorionate leva, injiceras embryon 30 minuter innan de uppnår önskad utvecklingsstadiet. Placera embryon i lugnande lösning (0,01% Tricaine i Embryo Medium) i 15 min.
2. Placera en droppe 1% agaros på en 35mm glas botten kultur skålen (Mattek, artikelnummer P35G-o-20-C).
3. Låt agaros att stelna.
4. Värme kapillärrör över eld för att göra tre hål i Agar (andra föremål såsom mikropipett tips kan användas för att göra hålen). Se till att det inte finns någon kvarstående agaros i hålets botten.
5. Fyll petriskål med Embryo Medium.
6. Använd ett glas pipett för att placera embryot i hålet.
7. Därefter orientera embryot med fin pincett så att det område som ska avbildas (dorsala huvudet) är i kontakt med glaset.
8. Försiktigt transporter petriskålen till mikroskop scenen (placera locket över petriskålen att förhindra avdunstning).
9. Medan avbildning, se till att embryona vid 28,5 ° C.

4. Resultat

Vi beskriver här ett okomplicerat förhållningssätt till bilden enstaka celler i zebrafisk neuralröret med mosaik uttryck. Trots den optiska insyn i zebrafisk embryot, har vi funnit att visualisering av neurala celler är kraftigt förbättrats i tvärsnitt erhålls genom en vibratome. Dessa avsnitt är tjock (50 mm) vilket möjliggör avbildning av cellulära förlängning från en viss cell i olika fokalplan med en konfokalmikroskop. Resultat med hjälp av denna metod har publicerats någon annanstans ^2, men representativa bilder av celler i neuralröret i en WT embryo (Figur 1) och en N-cadherin (N-CAD) mutant (Figur 2) tillhandahålls. Det senare visar att cellerna i laterala delar av neurala plattan i N-CAD mutanter misslyckas med att orientera rätt mot mittlinjen (Figur 2). I motsats till detta mosaik märkning, inte immunfärgning den neuroepithelium med en allmän cellytan markör såsom beta-catenin inte tillåta morfologi av enskilda celler som skall visualiseras (Figur 3).

Time lapse avbildning av levande embryon kompletteras mosaiken märkning av fasta prover, vilket möjliggör en bättre förståelse av de cellulära dynamik som sker under neurulation. Film 1 visar att WT celler aktivt migrera mot mittlinjen genom att utöka medialt orienterad membran utstickande delar.

Figur 1. MGFP uttryck i neuralröret i en WT zebrafisk embryo.

Figur 2. MGFP uttryck i neuralröret i en N-cadherin zebrafisk embryo.

Figur 3. B-catenin immuno färgning av neuroepithelium.

Discussion

Sammanfattningsvis beskrev etiketteknik här möjliggör enskild cell analys av morfogenetiska processer i zebrafisk embryot. Det primära fokus i detta protokoll om metoder för avbildning märkta celler i neuralröret med mGFP under kontroll av en allestädes närvarande promotor. För ytterligare tillämpningar av denna övergående läsare uttryck analys bör hänvisa till en färsk uppsats av Andersen et al. ^3.

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)