在斑马鱼后脑细胞标记和成像

Summary

理解，塑造了早期胚胎的形态发生过程的关键是对高分辨率图像细胞的能力。我们在这里描述膜有针对性的绿色荧光蛋白标签在整个斑马鱼的胚胎细胞的单细胞或小群的技术。

Abstract

理解，塑造了早期脊椎动物胚胎的形态发生过程的关键是对高分辨率图像细胞的能力。在斑马鱼胚胎注射，镶嵌表达质粒DNA结果，使细胞的单细胞或小群的可视化

Protocol

1.Microinjection

1. 稀释质粒编码的膜有针对性的绿色荧光蛋白（mGFP，礼貌理查德哈兰德）至40毫微克/毫升的浓度。 DNA是由线性质粒（mGFP/PCS2，礼貌理查德哈兰德）纯化使用Qiagen公司马克西准备包准备。酚红（稀释后总体积的1 / 10）的解决方案是首选的可视化解决方案。 DNA溶液置于冰上。
2. 在立体显微镜下，校准的注射针（90毫米Narishinge科学的玻璃毛细管，猫编号NA - GD - 1），对准在毕业的幻灯片针，轻轻拍打针直径为1微米的部分，用一个干净的剃刀刀片（获得一个适当大小的一角）。
3. 为了校准针注入已知体积（2nl），显微注射器具的针连接（PCI 100微量;哈佛器械）和前填写含有酚红和水放在一块解决方案0.5μL针石蜡。该解决方案可免除使用脚踏板。设置至7千帕的压力和不同的时间（10毫秒30msec），因此，它需要250踏板的解决方案，以免除0.5μL。
4. 在加湿100毫米的培养皿中的蜡地带，小心地校准针。加湿的菜，将周围的边缘湿Kimwipes（这可防止蒸发解决针）。
5. 使用微针的针尾（未校准结束）加载到0.5 -加入1μl的DNA。
6. 一旦该解决方案已经达到了针头，连接加载到显微注射器具使用的针。微量调整设置，以提供约2 / NL注射用脚踏。
7. 下一步，位置在中间充满了胚胎中等（1.0毫升汉克的联合1＃，比较上升零点一毫升汉克的股票2＃，1.0毫升汉克的股票＃4，95.9毫升DDH ₂ Ø，1.0毫升汉克的库存＃5一个基于Petri菜斑马鱼胚胎1.0毫升新鲜汉克的股票＃6，使用约10滴1 M NaOH溶液pH值7.2）。
8. 一旦胚胎发展所需的阶段，用细镊子轻轻夹住绒毛膜和位于进针注射针对性的区域。对于广泛mGFP的表达，注入1cell阶段的蛋黄或细胞质DNA。要限制mGFP表达到一个较小的区域，在4个（或更多）细胞阶段注入到一个单细胞的细胞质DNA。
9. 按显微注射器具的脚踏板，并提供约2 NL，确保该解决方案（可见由于酚红此外）是正确的注入。
10. 小心取出胚胎针。
11. 在培养皿中的所有胚胎重复。
12. 允许胚胎在28.5 ° C所需的阶段。
13. 轻轻剥落绒毛膜使用罚款钳（如果胚胎24hpf年轻，在玻璃培养皿dechorionating增加胚胎的成活率）Dechorionate胚胎。
14. 从培养皿菜使用的玻璃吸管取出空蛋壳。

2。 vibratome成像mGFP标记的部分

1. 使用玻璃吸管运输到固定液（4％多聚甲醛在1X的磷酸盐缓冲液（PBS）的胚胎。固定在4 ° C过夜胚胎。
2. 胚胎3次在1X PBS洗，每次5分钟。
3. 放置在培养皿中，用细镊子胚胎，除去蛋黄，不破坏胚胎的情况下。将尽可能多蛋黄。
4. 准备在H _{2 O} 4％低熔点琼脂糖
5. 塑料切片模具放入熔化的琼脂糖。
6. 用细镊子解除从培养皿中注入胚胎，并放置在琼脂糖东方。胚胎应定位于对模具的一端。
7. 琼脂糖硬化后，用一个平面工具，如压舌板，从模具取出琼脂糖块。
8. 琼脂糖块用刀片切底，以便它更是。
9. 添加超级胶水下降的vibratome阶段，和地方上的琼脂糖块（块被夷为平地剃刀方应面对胶水）。对于多个胚胎切片，安装在舞台上的几个琼脂糖包埋标本。
10. 将vibratome阶段的vibratome（Vibratome公司）。
11. 设置参数的vibratome常用的设置（速度3，厚度为50μm）。如果切片多个胚胎，在舞台上保持一致的琼脂糖块，并确保刀片穿过整个胚胎，但没有通过琼脂糖块的整个宽度（例如，对应相同的胚胎部分将留在一起）。
12. 倒入1X PBS vibratome阶段。
13. 科。
14. 一旦胚胎是sectio定义，删除琼脂糖块（S）从vibratome阶段。
15. 仔细分离切割琼脂糖块（S）的背面，每个部分。
16. 用细镊子选择所需的部分和地方填补一个PBS - 1X多井的菜（使用不同的部分对应不同的胚胎井）。
17. 重复每个胚胎。
18. 着手抗体标记，虽然23步骤19，加强mGFP成像（这一步可能没有必要的，如果成像在一天之内或准备两个部分）。
19. 在1X PBS阻塞的解决方案，以阻止非特异性结合，在室温下处理30分钟部分。
20. 一抗（兔A - GFP，Invitrogen公司的猫A11122号）：1:200稀释后在室温下为5小时或隔夜在振动筛上的一个封闭液在4 ° C孵育章节
21. 在1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液清洗4次（10分钟，15分钟，30分钟和60分钟，每个）。
22. 治疗与适当的封闭液中的二级抗体在室温下为5小时或隔夜节于4 ° C。
23. 在1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液清洗4次（10分钟，15分钟，30分钟和60分钟，每个）。
24. 治疗用DAPI（0.1％的DAPI于50ml 1X PBS; Invitrogen公司CAT号D1306）的部分为30分钟细胞核染色。
25. 在1X PBS三次，每次5分钟洗净。
26. 安装上滑动。
27. 利用共聚焦显微镜图像。

3。实时成像

1. Dechorionate生活，注入胚胎前30分钟，他们达不到预期的发展阶段。镇静的解决方案中的胚胎（0.01％Tricaine在胚胎中期）放置15分钟。
2. 放置一个35mm的玻璃底培养皿下降了1％琼脂糖（MatTek;零件编号P35G - O - 20 - C）。
3. 允许琼脂糖巩固。
4. 热毛细管以上的火焰，使琼脂糖3孔（可用于其他对象，如微量提示，使孔）。确保在孔底，没有残留的琼脂糖。
5. 与胚胎中等填充的培养皿中。
6. 使用玻璃吸管放置在洞口的胚胎。
7. 接下来，东方的胚胎，用细镊子，使该地区进行成像（背头）与玻璃接触。
8. 仔细运输培养皿显微镜阶段（放置在培养皿中，以防止水分蒸发的盖子）。
9. 虽然成像，确保胚胎在28.5 ° C。

4。结果

我们在这里介绍一个简单的方法，图像的单个细胞在斑马鱼神经管使用马赛克表达。尽管斑马鱼胚胎的光学透明性，我们发现，神经细胞的可视化是在使用一个vibratome获得截面大大增强。这些部分厚（50毫米）允许从一个给定的细胞在不同的使用共聚焦显微镜焦平面成像蜂窝扩展。结果使用这种方法已在其他地方发表^了 2，但代表的图像在一个WT胚胎（图1）和N -钙粘蛋白（N - CAD）的神经管细胞突变（图2）提供。后者揭示了该细胞中的突变体不能面向中线（图2）正常的神经板在N - CAD外侧地区。在这个镶嵌标签对比，与一般的细胞表面标志物，如β- catenin的神经上皮免疫不允许单个细胞形态的可视化（图3）。

时间失效成像活胚胎补充镶嵌固定标本的标签，从而使更好地理解了在神经胚细胞动力学。电影1显示，野生型细胞中线积极争取通过扩大内侧面向的膜突起迁移。

图1。mGFP表达一个WT斑马鱼胚胎的神经管。

图2。mGFP表达在一个N - cadherin的斑马鱼胚胎的神经管。

图3，B - catenin的免疫染色的神经上皮。

Discussion

总之，描述标签技术在这里允许在斑马鱼的胚胎形成过程的单细胞分析。此协议的主要重点是对成像标记在使用一个无处不在的启动子控制下的mGFP的神经管细胞的方法。对于这种瞬时表达检测读者的额外的应用程序应该是指一个由安德森等人最近的一篇文章 ^。3 。

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)