ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Summary

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。

Abstract

初期の脊椎動物の胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ゼブラフィッシュ胚、モザイク式の中のプラスミドDNAの結果の注入は、単一の細胞または細胞の小さなクラスターの可視化を可能に

Protocol

1.Microinjection

1. 希釈をコードするプラスミド膜をターゲットとした緑色蛍光タンパク質（MGFP、リチャードハーランドの礼儀）40 ng / mlの濃度に。 DNAはキアゲンのマキシプレップキットを使用して精製されたプラスミド（リチャードハーランドのmGFP/PCS2 +、礼儀）を線形化することによって調製される。ソリューションへのフェノールレッドの加算は、（総容積1 / 10に希釈）ソリューションを可視化することが好ましい。氷の上にDNA溶液を保管してください。
2. 累進的なスライドに針を合わせ、静かにきれいなかみそりを使用して直径が1μm以下である針の部分をタップすることで、実体顕微鏡下で、注射針を（カタログ番号NA - GD - 1 Narishinge科学から90ミリメートルのガラスキャピラリー）キャリブレーションブレード（適当な大きさの先端を得るために）。
3. ピース上に配置フェノールレッドと水を含む溶液の0.5μlを使用してニードルを記入し、フロント、知られているボリューム（2nl）を注入する針を較正するために、マイクロインジェクション装​​置（ハーバード大学の装置PCI 100マイクロインジェクター）に針を接続パラフィンの。解決策は、フットペダルを使用して省略することができる。 7 kPaに圧力を設定し、それが解決策の0.5μlディスペンス、250ペダルを取るように（10ミリ秒30msec）に変わる。
4. 加湿100ミリメートルペトリ皿の中のワックスのストリップに校正針を慎重に置きます。料理を加湿するために、エッジの周りの湿ったキムワイプを（これは針で溶液の蒸発を防ぐ）に置きます。
5. 針の端（キャリブレーションされていないエンド）へのDNAの0.5〜1μlをロードするためにマイクロピペットを使用してください。
6. ソリューションは、針の先端に達すると、マイクロインジェクション装​​置にロードするために使用された針の端を接続します。フットペダルを使用して約2 NL /注入を実現するためにインジェクターの設定を調整します。
7. 胚の培地（1.0ミリリットルハンクス証券第1位、0.1ミリリットルハンクの株式＃2、1.0ミリリットルハンクの証券第4位で満たされたペトリ皿の中央にある次の、位置のゼブラフィッシュの胚、95.9ミリリットルのddH ₂ O、1.0ミリリットルハンクス証券第5位、1.0 mlの新鮮なハンクの株式＃6、pH7.2に約10滴1 M NaOHを使用してください）​​。
8. 胚が目的の段階に開発が完了したら、軽く細かい鉗子で絨毛膜をつまんで、注射の対象となる領域に針を位置づける。広い範囲のMGFP式の場合は、卵黄または1セルの段階で細胞質にDNAを注入する。小さい領域にMGFPの発現を制限するには、単一のセルの細胞質中に4（またはそれ以上）の細胞の段階でDNAを注入する。
9. マイクロインジェクション装​​置のフットペダルを押すと、約2 NLを提供する、ソリューション（フェノールレッドの添加による目に見える）が適切に注入されることが保証されます。
10. 慎重に胚から針を取り除く。
11. ペトリ皿内のすべての胚について繰り返します。
12. 胚は28.5で、目的の段階に° Cを開発することができます。
13. 優しく細かい鉗子を（胚は、胚の生存率を増加させるガラスシャーレにdechorionating、24hpf未満である場合）を使用して絨毛膜を剥離することによりDechorionate胚。
14. ガラスピペットを用いてペトリ皿から空の絨毛膜を取り外します。

2。イメージングMGFP標識ビブラトームセクション

1. 1Xリン酸緩衝液（PBS）で固定液（4％パラホルムアルデヒドに胚を輸送するためにガラスのピペットを使用してください。4℃で一晩胚を修正しました。
2. 各5分間、1 × PBSで3回の胚を洗浄してください。
3. シャーレに胚を置くと、微細な鉗子を用いて、胚を損なうことなく、卵黄を削除します。できる限り多くの卵黄を削除します。
4. H _{2 O}で4％低融点アガロースを準備する
5. プラスチック切片金型内に溶融アガロースを置きます。
6. ペトリ皿から注入された胚を持ち上げ、アガロース内の場所と向きにするために微細な鉗子を使用してください。胚は、金型の一方の端に向かって配置する必要があります。
7. アガロースが硬化されると、金型からアガロースブ​​ロックを削除するには、そのようなヘラのように、平面のツールを使用してください。
8. それが偶数になるようにかみそりの刃を持つアガロースブ​​ロックの下端をカット。
9. ビブラトーム舞台にスーパー接着剤のドロップを追加し、その上にアガロースブ​​ロック（剃刀で横ばいしたブロックの側面に接着剤を直視しなければならない）を置きます。複数の胚を切片の場合は、ステージ上にいくつかのアガロース包埋標本をマウント。
10. ビブラトーム（ビブラトーム社）にビブラトームステージを取り付けます。
11. ビブラトームのパラメータを設定します（一般的な設定：速度-3、厚さ50μmの）。複数の胚をセクショニングの場合、ステージ上でアガロースブ​​ロックを合わせ、ブレードの全胚経由ではなく、アガロースブ​​ロック（同じ胚に対応するセクションが一緒に残ることなど）の全体幅を通過することを確認してください。
12. ビブラトーム段階での1X PBSを注ぐ。
13. セクション。
14. 胚は、切開されるとNED、ビブラトーム段階からアガロースブ​​ロック（複数可）を削除します。
15. 慎重にアガロースブ​​ロック（複数可）の後ろを切断することにより、各セクションを区切ります。
16. 1X PBSを充填したマルチウェルディッシュ（別の胚に対応するセクションに別の井戸を使用）に必要なセクションと場所を選択するために微細な鉗子を使用してください。
17. 各胚について、この手順を繰り返します。
18. 抗体標識を続行、MGFPイメージング（セクションは準備の一日か二日以内にイメージングされた場合は、この手順が不要な場合もあります）高めるために、23も19を繰り返します。
19. 非特異的結合をブロックするために1 × PBSでブロッキング溶液で、室温で30分間のセクションを扱います。
20. 一次抗体（ウサギA - GFP、Invitrogen社カタログ番号A11122）4、5、室温で数時間または一晩シェーカー上でブロッキング溶液で@ 1:200に希釈℃の切片をインキュベートします
21. 4回（10分、15分、30分および60分、各）1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液で洗浄する。
22. 4℃、室温または一晩で5時間ブロッキング溶液に適当な二次抗体を持つセクションを扱う℃に
23. 4回（10分、15分、30分および60分、各）1％BSA/1X PBS / 1％DMSO溶液で洗浄する。
24. 核を染色するために30分間、DAPI（Invitrogen社カタログ番号D1306 50ミリリットル1X PBSで0.1％DAPI）を使用してセクションを扱う。
25. 5分間ずつ1X PBSで3回洗浄する。
26. スライド上にマウントします。
27. 共焦点顕微鏡を使用してイメージ。

3。ライブイメージング

1. ライブDechorionate、それらが所望の発達段階に到達する30分前に胚を注入した。 15分間鎮静剤溶液中での胚（胚の培地中0.01％Tricaine）を置きます。
2. （;品番P35G - O - 20 - Cマテック）35ミリメートルのガラス底の培養皿上に1％アガロースの低下を置きます。
3. アガロースを固化することができます。
4. アガロースの3つの穴を（そのようなマイクロピペットの先端のような他のオブジェクトは穴を作るために使用されることがあります）ように炎上熱毛細管。残存アガロースは、穴の底ではないことを確認してください。
5. 胚培地でシャーレを埋める。
6. 穴に胚を配置するガラスピペットを使用してください。
7. 次に、オリエント胚は（背側頭部）の領域がイメージを作成するように微細な鉗子を使用して、ガラスと接触している。
8. 注意深く顕微鏡ステージ（蒸発を防ぐために、ペトリ皿上に蓋を置く）にペトリ皿を運ぶ。
9. イメージングしながら、胚は℃、28.5になっていることを確認してください

4。結果

ここでは、モザイクの表現を用いてゼブラフィッシュ神経管の画像単一細胞への直接的なアプローチを説明します。ゼブラフィッシュ胚の光透過性にもかかわらず、我々は神経細胞の可視化が大幅にビブラトームを用いて得られた断面に増強されることを見出した。これらのセクションでは、共焦点顕微鏡を用いて異なる焦点面内の特定の細胞から細胞の拡張子のイメージングを可能にする（50 mm）の厚さです。この方法論を使用して結果を別の場所で²公開されているが、WT胚（図1）とN -カドヘリン（N - CAD）変異体（図2）の神経管の細胞の代表的な画像が提供されています。後者は、N - CADの変異体は正中線（図2）に向けて適切に方向付けるために失敗に神経板の外側の領域でその細胞を明らかにする。このモザイクのラベリングとは対照的に、このようなβ-カテニンなどの一般的な細胞表面マーカーと上皮を免疫染色すると、個々の細胞の形態は（図3）可視化することはできません。

ライブ胚のタイムラプスイメージングが神経胚形成の間に起こる細胞のダイナミクスの理解を可能にする、固定標本のモザイクのラベルを補完。ムービー1はWT細胞が積極的に内方に向いた膜の突起を拡張することで、正中線に向かって移行することを明らかにした。

WTゼブラフィッシュ胚の神経管に図1。MGFP式。

N -カドヘリンのゼブラフィッシュ胚の神経管2。MGFP式図 。

神経上皮の図3。B -カテニン免疫染色。

Discussion

結論では、標識技術は、ゼブラフィッシュ胚における形態形成のプロセスの単一細胞の分析を可能にするここで説明する。このプロトコルの主な重点は、ユビキタスプロモーターの制御下MGFPを使用して、神経管のイメージング標識細胞のための方法になります。この一過性発現アッセイのリーダーの追加のアプリケーション用にアンデルセンらによる最近の論文を参照する必要があります^。3。

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)