Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Summary

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Abstract

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege gewervelde embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. In de zebravis embryo's, injectie van plasmide DNA resulteert in een mozaïek expressie, waardoor voor de visualisatie van losse cellen of kleine clusters van cellen

Protocol

1.Microinjection

1. Verdunnen plasmide coderend voor membraan-gerichte Green Fluorescent Protein (mGFP, met dank aan Richard Harland) tot een concentratie van 40 ng / ml. DNA wordt bereid door lineariseringsschakelingen plasmide (mGFP/PCS2 +, met dank aan Richard Harland) gezuiverd met behulp van de Qiagen Maxi Prep Kit. Toevoeging van fenol rood (1 / 10 verdund totaal volume) aan de oplossing heeft de voorkeur om de oplossing te visualiseren. Houden DNA-oplossing op het ijs.
2. Onder een stereomicroscoop, kalibreren van de injectienaald (90mm glas capillairen van Narishinge Scientific; Cat No NA-GD-1) door aanpassing van de naald op een afgestudeerd glijbaan en zachtjes tikken op het gedeelte van de naald waar de diameter is 1 uM met een schone scheermes mes (een tip van de juiste grootte te verkrijgen).
3. Met het oog op de naald te kalibreren om een ​​bekend volume (2NL) injecteren, sluit u de naald op de micro-injectie apparaat (PCI 100 Microinjector; Harvard Apparatus) en de voorkant van de naald te vullen met 0.5μl van een oplossing die fenol rood en water op een stuk van paraffine. De oplossing kan worden afgezien van het gebruik van een voetpedaal. Stel de druk om 7 kPa en variëren de tijd (10msec 30msec) zodat het duurt 250 pedalen af ​​te zien van 0.5μl van de oplossing.
4. Plaats voorzichtig de gekalibreerde naald op een strook van was in een bevochtigde 100 mm petrischaal. Te bevochtigen de schotel, plaats nat Kimwipes rond de randen (dit voorkomt verdamping van de oplossing in de naald).
5. Gebruik een micropipet tot 0,5-1μl van DNA te laden in de naald einde (het einde dat niet is gekalibreerd).
6. Zodra de oplossing is bereikt, de naald tip, sluit u het uiteinde van de naald die werd gebruikt voor het laden van een micro-injectie apparaat. Pas de instellingen op de microinjector tot ongeveer 2 nl / injectie met behulp van een voetpedaal te leveren.
7. Vervolgens positie zebravis embryo's in het midden van een petrischaal gevuld met embryo's Medium (1,0 ml Hank's Stock # 1, 0,1 ml Hank's Stock # 2, 1,0 ml Hank's Stock # 4, 95,9 ml DDH ₂ O, 1,0 ml Hank's Stock # 5 , 1,0 ml verse Hank's Stock # 6, Gebruik ongeveer 10 druppels 1 M NaOH tot pH 7,2).
8. Zodra de embryo's ontwikkeld om de gewenste fase, voorzichtig de greep van de chorion met fijn pincet en situeren de naald in het gebied gerichte voor injectie. Voor een breed scala mGFP uitdrukking, injecteren van DNA in de dooier of het cytoplasma in de 1cell stadium. Om de expressie van mGFP te beperken tot een kleiner gebied, injecteren DNA op de vier (of meer) cellen stadium in het cytoplasma van een enkele cel.
9. Druk op het voetpedaal van de micro-injectie apparatuur en leveren ongeveer 2 nl, ervoor te zorgen dat de oplossing (zichtbaar als gevolg van de toevoeging van fenol rood) goed is geïnjecteerd.
10. Verwijder voorzichtig de naald uit de embryo.
11. Herhaal dit voor alle embryo's in de petrischaal.
12. Laat embryo's te ontwikkelen op 28,5 ° C tot de gewenste podium.
13. Dechorionate embryo's door voorzichtig afpellen van de chorion met fijn pincet (als embryo's zijn jonger dan 24hpf, dechorionating in een glazen petrischaal verhoogt de overlevingskans van embryo's).
14. Verwijder lege chorion uit de petrischaal met een glazen pipet.

2. Imaging mGFP-gelabeld vibratome secties

1. Gebruik een glazen pipet om embryo's te vervoeren in fixatief (4% paraformaldehyde in 1X fosfaatbufferoplossing (PBS). Fix embryo's bij 4 ° C gedurende de nacht.
2. Was de embryo's in 1X PBS drie keer voor vijf minuten elk.
3. Plaats de embryo's in petrischaal en, met behulp van fijne tang, verwijder dan de dooier zonder beschadiging van het embryo. Verwijder zoveel mogelijk dooier.
4. Bereid 4% laag-melt agarose in H ₂ O.
5. Plaats gesmolten agarose in plastic snijden mal.
6. Gebruik fijne tang om een ​​embryo geïnjecteerd lift van de petrischaal en plaats en oriënteren in de agarose. Het embryo moet worden geplaatst aan een uiteinde van de mal.
7. Nadat de agarose is gehard, gebruik dan een vlakke ondergrond hulpmiddel, zoals een spatel om de agarose blok te verwijderen uit de mal.
8. Snijd de onderkant van de agarose blok met een scheermesje, zodat het zelfs.
9. Voeg een druppel superlijm aan de vibratome podium en plaats de agarose blok op het (de kant van het blok dat was uitgeschakeld gelijk met het scheermes moet de lijm gezicht). Voor het snijden meerdere embryo's, monteert diverse agarose-ingebedde monsters op het podium.
10. Bevestig de vibratome podium om de vibratome (Vibratome, Inc.)
11. Stel de parameters van de vibratome (gemeenschappelijke instellingen: speed-3, dikte-50μm). Als snijden meerdere embryo's, af te stemmen agarose blokken op het podium en ervoor te zorgen dat het blad gaat door de hele embryo, maar niet door de hele breedte van de agarose blokken (zoals die secties die overeenkomen met dezelfde embryo bij elkaar blijven).
12. Giet 1X PBS in de vibratome podium.
13. Sectie.
14. Zodra de embryo's Sectioned, verwijder de agarose blok (s) van de vibratome podium.
15. Voorzichtig aparte elke sectie door het snijden van de achterkant van de agarose blok (s).
16. Gebruik fijn pincet om de gewenste onderdelen en plaats te selecteren in een 1X PBS gevulde multi-en schotel (gebruik van verschillende bronnen voor de secties die overeenkomen met verschillende embryo's).
17. Herhaal dit voor elk embryo.
18. Ga verder met antilichaam labeling, stappen 19 maar 23, te verbeteren mGFP imaging (deze stap misschien niet nodig zijn als onderdelen worden afgebeeld binnen een dag of twee van de voorbereiding).
19. Behandel delen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met het blokkeren van oplossing in 1X PBS om niet-specifieke binding te blokkeren.
20. Incubeer secties met primaire antilichaam (konijn een-GFP, Invitrogen Cat No A11122) verdund @ 1:200 in het blokkeren oplossing op een shaker voor 5 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
21. Was viermaal uit (10 min, 15 min, 30 min en 60 min, elk) in 1% BSA/1X PBS / 1% DMSO oplossing.
22. Behandel secties met passende secundaire antilichaam in het blokkeren van oplossing gedurende 5 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
23. Was viermaal uit (10 min, 15 min, 30 min en 60 min, elk) in 1% BSA/1X PBS / 1% DMSO oplossing.
24. Behandel de secties met DAPI (0,1% DAPI in 50 ml 1X PBS; Invitrogen Cat No D1306) gedurende 30 minuten naar de kernen vlek.
25. Was drie keer in 1X PBS gedurende 5 minuten elk.
26. Monteren op dia.
27. Afbeelding met behulp van confocale microscopie.

3. Live-imaging

1. Dechorionate live, geïnjecteerde embryo's 30 minuten voordat ze de gewenste ontwikkelingsstadium. Plaats de embryo's in sederende-oplossing (0,01% tricaïne in Embryo Medium) gedurende 15 minuten.
2. Plaats een daling van 1% agarose op een 35 mm glazen bodem cultuur schotel (MatTek; Part No P35G-o-20-C).
3. Laat agarose stollen.
4. Warmte capillair dan vlam drie gaten in agarose (andere voorwerpen zoals micropipet tips kunnen worden gebruikt om de gaten te maken) te maken. Zorg ervoor dat er geen resterende agarose in het gat onderaan.
5. Vul de petrischaal met Embryo Medium.
6. Gebruik een glazen pipet om het embryo in het gat.
7. Vervolgens richten de embryo met behulp van fijne tang, zodat het gebied afgebeeld worden (dorsale hoofd) in contact komt met het glas.
8. Zorgvuldig vervoer van de petrischaal op de microscoop stage (plaats het deksel op de petrischaal om verdamping te voorkomen).
9. Terwijl imaging, ervoor zorgen dat de embryo's bij 28,5 ° C.

4. Resultaten

We beschrijven hier een directe aanpak om de afbeelding individuele cellen in de zebravis neurale buis met behulp van mozaïek expressie. Ondanks het optische transparantie van de zebravis embryo, hebben we ontdekt dat visualisatie van neurale cellen sterk is verbeterd in dwarsdoorsneden verkregen met behulp van een vibratome. Deze secties zijn dik (50 mm) waardoor beeldvorming van cellulaire extensie van een bepaalde cel in verschillende brandpunten vliegtuigen met behulp van een confocale microscoop. Resultaten met behulp van deze methode zijn elders ² gepubliceerd, maar representatief beeld van de cellen in de neurale buis van een WT embryo (figuur 1) en een N-cadherine (N-cad) mutant (figuur 2) zijn voorzien. Dit laatste toont aan dat cellen in de laterale delen van de neurale plaat in N-cad mutanten niet goed te oriënteren naar de middellijn (figuur 2). In tegenstelling tot deze mozaïek etikettering, doet immunokleuring de neuroepithelium met een algemene celoppervlak marker, zoals beta-catenine niet toe dat de morfologie van individuele cellen kunnen worden gevisualiseerd (figuur 3).

Time lapse imaging van levende embryo's aanvulling op de mozaïek etikettering van vaste monsters, waardoor een beter begrip van de cellulaire dynamiek die plaatsvinden tijdens neurulatie. Film 1 is gebleken dat WT cellen actief de richting van de middellijn migreren door de uitbreiding van mediaal gerichte membraan uitsteeksels.

Figuur 1. MGFP uitdrukking in de neurale buis van een WT zebravis embryo.

Figuur 2. MGFP uitdrukking in de neurale buis van een N-cadherine zebravis embryo.

Figuur 3. B-catenine immuno kleuring van de neuroepithelium.

Discussion

Kortom, de etikettering hier beschreven technieken zorgen voor enkele cel analyse van morfogenetische processen in de zebravis embryo. De primaire nadruk van dit protocol is over de methoden voor de beeldvorming gelabelde cellen in de neurale buis met behulp van mGFP onder de controle van een alomtegenwoordige promotor. Voor extra toepassingen van deze transiënte expressie test lezers worden verwezen naar een recent artikel van Andersen et al.. ^3.

Materials

Solutions

Hank's Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O Hank's Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O Hank's Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O Hank's Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3 Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)