1. Metodi di consegna sistemica Anche se la consegna di farmaci sistemici non è l'approccio più efficiente per raggiungere elevate concentrazioni del farmaco nel sistema nervoso centrale, le consegne sistemici sono comodi e ben accettato dai pazienti. Qui dimostreremo procedure corrette per tre approcci sistemici solitamente usata somministrazione: iniezione endovenosa, iniezione intraperitoneale, e sonda gastrica. A. iniezione per via endovenosa (Vein iniezione di coda) Prima di iniziare la procedura, il peso corporeo di ogni mouse deve essere registrato. Come per tutti gli studi preclinici, il peso corporeo devono essere controllati regolarmente (due volte alla settimana o più) per valutare la potenziale tossicità dei farmaci. Non oltre l'1% del peso corporeo del mouse in volume dovrebbe essere iniettato in una sola volta. Per esempio, non più di 0,2 ml di liquido deve essere iniettato in un topo 20g. Tutti i fluidi iniettati per via endovenosa deve essere sterilizzati con un metodo appropriato. Il mouse deve essere portata per 5-10 minuti utilizzando una piastra elettrica o una lampada di calore per dilatare la vena della coda. Se si utilizza una lampada di calore, monitorare il mouse in qualsiasi momento per evitare l'ipertermia. Il mouse è trasferito ad un dispositivo di ritenuta, che trattiene il mouse, consentendo l'accesso alla vena della coda (vedi video). Nella coda di topo ci sono quattro vasi visibili: i vasi sui lati dorsale e laterali sono le vene, e la nave sul lato ventrale è un'arteria. Per accedere alla vena della coda, la coda del topo si tiene presso il punto più distale, e ruotato di 90 gradi in modo che la vena è rivolto verso l'alto. Il sito di iniezione viene pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di alcool e una siringa da insulina 28g viene inserito, lato smussato alto, nella vena (vedi video). Se l'ago è correttamente posizionato nella vena, dovrebbe muoversi liberamente e senza pressioni. Iniettare lentamente il farmaco con una pressione uniforme sul 5-10 secondi. Se una bolla appare sulla coda, stop iniezione in quanto questo indica che l'ago non è più in vena. Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione al sito di iniezione fino a quando l'emorragia si ferma. Questa operazione richiede normalmente 30-60 secondi. Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l'iniezione per assicurarsi che non ci sono ulteriori emorragie. B. iniezione intraperitoneale Prima di iniziare l'iniezione, il farmaco deve essere caricato in una siringa collegata ad un ago 28g. Assicurarsi che ci sia spazio nella siringa per il disegno indietro il pistone prima dell'iniezione (ad esempio, se l'iniezione 200μL, assicurarsi che la capacità siringa è 300μL o superiore). Rimuovere il mouse dalla gabbia per la coda e collocarla su una superficie strutturata, in modo che il mouse ha qualcosa da presa. Un coperchio gabbia di solito è sufficiente. Lasciare che il mouse per allungare il suo corpo e poi usare i tuoi mano non dominante, afferrare la pelle sul dorso del mouse, avendo cura di pizzicare leggermente la pelle il più possibile tra il pollice e indice e il medio (vedi video). Girare il mouse in modo che l'addome del mouse è rivolto verso l'alto. Se il mouse può liberamente muovere la testa, rilasciare la presa e riprovare, in modo da evitare di essere morsi durante l'iniezione. Con la mano dominante, prendere la siringa ed inserire l'ago con un angolo di 30 gradi nel quadrante in basso a sinistra del mouse (vedi video). Tenendo il mouse leggermente invertita aiuterà spostare gli organi di distanza dal sito di iniezione. Per assicurarsi che l'ago sia nello spazio intraperitoneale, tirare indietro lo stantuffo della siringa. Se qualsiasi liquido o sangue appare nella siringa, poi l'ago non è nello spazio intraperitoneale e deve essere rimosso. Se non fluido è aspirato nella siringa, iniettare il contenuto della siringa con una pressione uniforme sul 1-5 secondi e rilasciare il mouse. Monitorare il mouse per 5-10 minuti dopo l'iniezione per assicurare che il mouse ritorna a livelli normali attività. C. orale Gavage Prima di iniziare l'iniezione, registrare il peso del mouse. Il volume massimo che può essere consegnato mediante sonda gastrica è 10 ml per chilogrammo di peso corporeo. Per esempio, il volume massimo di un mouse 20g sarebbe 200μL. Tentare di iniettare maggiori volumi può causare reflusso, che causerà consegna incompleta droga. Se è necessario somministrare maggiori volumi rispetto a quello sopra, fino a tre dosi possono essere somministrate in 24 ore. Per evitare la puntura del esofago, è importante misurare la lunghezza dell'ago sonda gastrica per ogni mouse. In possesso di una punta 18g palla ago curvo sonda gastrica al livello dell'ultima costola del mouse, e segnare la lunghezza alla punta della testa del mouse utilizzando un pennarello indelebile (vedi video). Durante la sonda gastrica, questo marchio sarà un punto di sosta quando si inserisce l'ago nella bocca del mouse. Trattenere il mouse utilizzando la stessa presa per mano come un'iniezione intraperitoneale. Inserire l'ago sonda gastrica in bocca, sulla lingua, e ADVAUna volta che l'ago attraverso la faringe. Non inserire l'ago passato il segno di fermarsi. L'ago dovrebbe procedere senza intoppi, senza alcuna pressione (vedi video). Se si verificano pressioni, stop e togliere l'ago per evitare l'iniezione di liquido nei polmoni. Con l'ago in posizione, spingere il pistone in 1-5 secondi e quindi rimuovere l'ago lo stesso angolo che è stato inserito. Monitorare il mouse per 5-10 minuti, prestando attenzione a eventuali segni di respiro affannoso che potrebbe indicare che il liquido è entrato nei polmoni. 2. Consegna locali Acuta convezione-Enhanced consegna A. Sonda Costruzione Un reflusso resistente cannula CED per i roditori non è ancora disponibile in commercio. Qui si dimostrerà un metodo per la costruzione cannula che è stata adattata da un primo metodo descritto da Krauze et al (Krauze 2005). La cannula ha tre parti (figura 1): 100um tubo di silice di diametro attraverso il quale i flussi infusate, un ago metallico rigido per il supporto strutturale, e tubi flessibili in teflon per il caricamento del infusate. Per ottenere l'asta rigida di metallo, usare fiamme libere per fondere la plastica su un catetere Surflo IV (24g stiletto) e con delle pinzette rimuovere l'ago metallico. Il resto del catetere può essere scartata. Tagliare un pezzo di tubo di silice (OD 0,163 millimetri), leggermente più lungo che l'ago metallico, utilizzando un singolo filo della lama di rasoio. Ruolo il tubo di silice in una piccola goccia di cianoacrilato base ad azione rapida adesivo (ad esempio Krazy Glue), avendo cura di non avere la colla sulle estremità del tubo. Inserire il tubo di silice nella ago di metallo e lasciare asciugare per 5 minuti. Una volta asciutto, il tubo di silice devono essere saldamente apposta ago. Le estremità della silice deve essere tagliato in modo che sporge di 2 millimetri di silice tubo dal l'estremità appuntita dell'ago e 3mm di silice tubo sporge dalla fine piatta (vedi video). Tagliare una sezione di tubo in Teflon 20 cm di lunghezza. Rotolo l'ago di metallo in una piccola goccia di adesivo, sempre facendo attenzione a non prendere la colla sulle estremità del tubo di silice in quanto ciò ostruire la cannula. Inserire l'ago nel tubo in Teflon ad una profondità di 1 cm. Lasciate asciugare per 1 minuto. Utilizzando una pistola per colla, applicare una goccia di colla a caldo al giunto tra l'ago metallico e il tubo in Teflon (vedi video). Assicurarsi che il comune è coperto su tutti i lati e lasciare asciugare per almeno 1 ora. Cannule possono essere effettuate fino a una settimana di anticipo e conservato a temperatura ambiente. B. Procedura di Infusione Per preparare l'area chirurgica, tutte le superfici devono essere irrorate con un disinfettante, come ad esempio una soluzione di clorexidina al 2%. Guanti chirurgici sterili dovrebbero essere indossati durante la procedura. Le superfici vengono poi coperti con drappi assorbente. Le seguenti forniture deve essere posto in zona chirurgica: Riscaldamento pad per mantenere la temperatura corporea del mouse Due piccoli piatti Petri, uno contenente perossido di idrogeno al 3%, e uno contenente 2% di clorexidina Garza sterile e cotone tamponi Bisturi sterili monouso (Numero 21) Aghi sterili 22g Topo stereotassica telaio Controllato tasso di pompa a siringa Autoclave del mouse pelle cucitrice, graffette, e rimozione di base Per configurare la cannula CED, allegare una siringa 1 ml al tubo in Teflon utilizzando un set di adattatori siringa di plastica. La cannula deve essere applicata al telaio stereotassico in modo che sia perpendicolare alla superficie chirurgico (vedi video). Per disinfettare la cannula, riempire la siringa con 1 ml di etanolo al 70% e premere lo stantuffo per eseguire l'etanolo attraverso la cannula. Ripetere questo processo con una soluzione fisiologica sterile, e controllare eventuali perdite intorno alle articolazioni cannula. Per disinfettare la parte esterna della cannula, pulire delicatamente con etanolo al 70% pulire. Riempire la cannula con soluzione salina sterile e poi tirare indietro siringa in modo che una piccola bolla d'aria è aspirata nella cannula. Questa bolla d'aria separerà le infusate dal salino nella cannula. Poi, backload tuo infusate (vedi video). Collegare la siringa alla pompa siringa e adescare la pompa con una breve esecuzione della cannula. Sedare il mouse utilizzando un anestetico iniettato e preparare la pelle dal tampone più volte (per 5-10 secondi) con un pezzo di garza sterile immerso nella soluzione di clorexidina al 2%. Pomata oftalmica deve essere applicato il mouse per mantenere l'umidità adeguata durante la procedura. Usando un bisturi sterile, creare una incisione sagittale lungo il centro del cranio, lungo circa 1,5 centimetri (vedi video). La superficie del cranio è poi puliti con un tampone di cotone imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Fare attenzione per evitare di perossido di idrogeno agli occhi del mouse. Le linee di sutura del cranio dovrebbe essere evidente a questo punto: se non sono visibili, tampone delicatamente il cranio con un fresh batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Identificare il bregma (Figura 2) e quindi misurare 2mm a destra e posteriore 1mm di questa struttura per individuare il sito di infusione. Utilizzando l'ago sterile 22g, delicatamente creare un foro nel cranio, a questo punto ruotando l'ago contro il cranio (vedi video). Evitare assolutamente di forzare l'ago verso il basso contro il cranio. A questo punto, il mouse deve essere posizionato nel frame stereotassico e iniziare a ricevere anestesia per via inalatoria (vedi video). Somministrare l'anestetico ad un livello basso (1%), e monitorare attentamente il mouse per i cambiamenti nel tasso di respirazione, regolando di conseguenza l'anestetico. Posizionare la cannula sopra il foro del cranio e quindi abbassare 3 mm sotto la superficie del cranio. Iniziare l'infusione, applicando le seguenti aliquote e le durate: 0,1 microlitri / min per 5 minuti 0,2 microlitri / min per 5 minuti 0,5 microlitri / min per 5 minuti 0,8 microlitri / min per 7,5 minuti OFF per 1 minuto Al termine dell'infusione, rimuovere lentamente la cannula e tampone del cranio con perossido di idrogeno al 3%. Applicare la cera sterile osso al foro (vedi video). Utilizzando pinze, disegnare la pelle insieme il cranio e fiocco a chiudere. Buprenorfina deve essere somministrato per il post-operatorio del dolore. Monitorare il mouse post-operatoria fino a quando non riprende conoscenza e di mobilità. A causa della lunghezza della procedura, può richiedere fino a un'ora per il mouse per riguadagnare piena attività. Durante questo tempo il luogo della gabbia del mouse su una piastra elettrica per evitare l'ipotermia, e non la casa del topo recupero con altri topi attivi. Graffette pelle deve essere rimosso una settimana dopo l'intervento chirurgico. C. imaging in vivo Infusate fluorescenza marcato può essere ripreso in seguito alla somministrazione CED, e possono essere monitorati per i cambiamenti di intensità del segnale e posizione del segnale. In genere, è meglio aspettare 2-3 ore dopo l'infusione di immagine, in modo da consentire il mouse per recuperare l'infusione. Per l'anestesia durante l'imaging, usare un basso livello di un anestetico per via inalatoria. Posizionare il mouse, lato dorsale alto, in una stazione di imaging (ad esempio, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Utilizzando un filtro impostazione appropriata per il fluoro, che viene esposta, acquisire un'immagine. Per CED, un infuso di successo dovrebbe mostrare maggior parte del materiale del cervello in prossimità del sito di infusione (Figura 3). 3. Rappresentante Risultati La mancanza di reazione avversa alla somministrazione della terapia è un importante indicatore di iniezione di successo. Per esempio, dopo l'iniezione coda vena ci dovrebbe essere nessun cambiamento di aspetto (ad esempio, dimensioni, colore) della coda. Una bolla o blister dopo l'iniezione coda vena indicherebbe sottocutanea, piuttosto che per via endovenosa, la consegna della terapia. Per iniezioni intraperitoneali, un urto sulla pelle o decolorazione dell'addome può indicare iniezione sottocutanea o danni alle strutture interne. In sonda gastrica, un mouse con respiro affannoso o tosse può indicare che il liquido è stato iniettato nei polmoni, invece che nello stomaco. Per CED, la funzione neurologica è importante per valutare la somministrazione di successo della terapia. Un mouse che sta esibendo convulsioni o emiparesi potrebbe aver ricevuto una infusione improprio. Se un infusate fluorescente viene utilizzato, imaging in vivo può essere applicato per la valutazione della efficacia dell'amministrazione (Figura 3). Se il infusate non è localizzata al sito di iniezione, l'infusione non ha avuto successo. Figura 1: Cannula CED e Chirurgiche Set-up. Gli elementi di base della convezione avanzata parto chirurgico set-up sono mostrati. Una pompa microinfusion (A) è collegato alla cannula di infusione (B, l'ingrandimento in alto). Una cornice stereotassica (C) viene utilizzato per posizionare la sonda. Questa immagine non comprendono il riscaldamento e le attrezzature anestetico utilizzato anche durante la procedura. Figura 2: Mouse linee di sutura Teschio. Il sito di infusione CED (stella rossa) può essere localizzato, individuando l'intersezione delle suture sagittali e coronali (il bregma) e poi misura due millimetri laterale e 1 millimetro posteriore del bregma. Figura 3: Risultati Rappresentante CED di successo. Liposomes etichettati con un far-rosso colorante fluorescente sono state infuse nel cervello di topo da CED e ripreso sia in vivo ed ex vivo. Una infusione di successo mostra un segnale fluorescente localizzato al sito di infusione sia in vivo (A) ed ex vivo (B). Il segnale deve essere localizzata nell'emisfero infusa senza dispersione nell'emisfero controlaterale. Figura 4: Immagine rappresentante del CED di successo nel tronco cerebrale di ratto. Liposomi fluorescenza-marcato infuse in tronco cerebrale di ratto. Nei ratti, per quanto 20μL può essere infusa. Lo spessore maggiore del cranio ratto e la profondità di iniezione precluso imaging in vivo, ma la posizione infusione corretta potrebbe essere verificato da ex-imaging in vivo del cervello sezionato.