Entrega da droga sistêmica e local para o tratamento de doenças do sistema nervoso central em modelos de roedores

Summary

Testes pré-clínicos completa de drogas que atuam no sistema nervoso central, muitas vezes envolve a avaliação e comparação de biodistribuição da droga em associação com rotas específicas de administração. Aqui, três métodos comumente utilizados de entrega sistêmica (intravenosa, intraperitoneal e oral), bem como um método para entrega local (convecção avançada entrega) são demonstrados em camundongos.

Abstract

Testes pré-clínicos completa do sistema nervoso central (SNC) terapêutica inclui uma reflexão sobre as vias de administração e biodistribuição agente em avaliação da eficácia terapêutica. Entre as duas principais classificações de administração, local versus sistêmica, abordagem sistêmica de entrega são muitas vezes preferido devido à facilidade de administração. No entanto, a entrega sistêmica pode resultar em concentração do fármaco suboptimal sendo alcançados no SNC, e levar a conclusões errôneas em relação à eficácia do agente. Métodos de entrega local de drogas são mais invasivos, mas pode ser necessário para atingir níveis terapêuticos CNS drogas. Aqui, demonstramos a técnica adequada para três rotas de entrega de medicamentos sistêmicos: injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral. Além disso, vamos mostrar um método para entrega local para o cérebro: convecção avançada de entrega (CED). O uso de compostos fluorescentes marcado é incluído para in vivo de imagens e verificação de administração do medicamento adequado. Os métodos são apresentados usando modelos murinos, mas pode facilmente ser adaptado para uso em ratos.

Protocol

1. Sistêmica Métodos de entrega

Apesar de administração sistêmica de drogas não é a abordagem mais eficiente para atingir concentrações elevadas de drogas no SNC, as entregas sistêmica são convenientes e bem aceito pelos pacientes. Aqui, iremos demonstrar os procedimentos adequados para três abordagens de rotina usado administração sistêmica: a injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, e gavagem oral.

A. injeção intravenosa (injeção veia da cauda)

1. Antes de iniciar o procedimento, o peso corporal de cada rato devem ser registrados. Como em todos os estudos pré-clínicos, o peso corporal deve ser monitorada regularmente (duas vezes por semana ou mais) para avaliar a toxicidade potencial da droga. Não mais do que 1% do peso corporal do rato no volume deve ser injetado em uma única vez. Por exemplo, não mais que 0,2 mL de líquido deve ser injetado em um rato 20g. Todos os fluidos injetados por via intravenosa devem ser esterilizados por um método apropriado.
2. O mouse deve ser aquecido por 5-10 minutos usando uma almofada de aquecimento ou de uma lâmpada de calor para dilatar a veia da cauda. Se estiver usando uma lâmpada de calor, monitorar o mouse em todos os momentos para evitar hipertermia.
3. O mouse é transferido para um dispositivo de fixação, que restringe o mouse, permitindo o acesso à veia caudal (ver vídeo). Na cauda do rato, existem quatro vasos visíveis: os vasos nos lados dorsal e lateral são veias, eo navio no lado ventral é uma artéria. Para acessar a veia da cauda, ​​a cauda do rato é realizada no ponto mais distal, e rotação de 90 graus, para que a veia é voltado para cima. O local da injeção é limpo com um algodão embebido em álcool e uma seringa de insulina 28g é inserido, o lado chanfrado para cima, para dentro da veia (ver vídeo). Se a agulha está correctamente colocada na veia, ela deve mover-se livremente e sem pressão. Lentamente injetar a droga, mesmo com a pressão mais de 5-10 segundos. Se uma bolha aparece na cauda, ​​pare de injetar, pois isso indica que a agulha não está mais na veia.
4. Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare. Isso normalmente leva 30-60 segundos. Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que não há mais sangramento.

B. injeção intraperitoneal

1. Antes de iniciar a injeção, a droga deve ser carregado em uma seringa conectada a uma agulha 28g. Certifique-se que há espaço na seringa para desenhar o êmbolo antes da injeção (por exemplo, se injetar 200μL, certifique-se que a capacidade da seringa é 300 ul ou superior).
2. Remova o mouse da gaiola por sua cauda e colocá-lo em uma superfície texturizada, para que o mouse tem algo a aderência. Uma tampa de gaiola é geralmente suficiente. Permitir que o mouse para esticar seu corpo e em seguida, usando sua mão não-dominante, segure a pele na parte de trás do rato, tendo o cuidado de ânimo leve pitada de pele, tanto quanto possível entre o polegar eo dedo indicador e médio (ver vídeo). Vire o mouse de forma que o abdômen do mouse é virada para cima. Se o rato pode se mover livremente sua cabeça, solte a pegada e tentar novamente, de forma a evitar ser picado durante a injecção.
3. Com sua mão dominante, pegar a seringa e insira a agulha em um ângulo de 30 graus no quadrante inferior esquerdo do mouse (ver vídeo). Segurando o mouse ligeiramente invertida vai ajudar a mover os órgãos de distância do local da injeção. Para garantir que a agulha está no espaço intraperitoneal, puxe o êmbolo da seringa. Se qualquer líquido ou sangue aparece na seringa, a agulha não está no espaço intraperitoneal e deve ser removido. Se nenhum líquido é aspirado para dentro da seringa, em seguida, injetar o conteúdo da seringa com uma pressão ainda mais de 1-5 segundos e solte o mouse.
4. Monitorar o mouse por 5-10 minutos após a injeção para assegurar que o mouse volta a níveis de atividade normal.

C. Oral Gavage

1. Antes de iniciar a injeção, registro do peso do mouse. O volume máximo que pode ser entregue por sonda oral é 10 ml por quilo de peso corporal. Por exemplo, o volume máximo de um rato 20g seria 200μL. A tentativa de injetar grandes volumes pode resultar em refluxo, o que fará a entrega da droga incompleta. Se for necessário administrar volumes maiores que as apontadas acima, até três doses podem ser administradas mais de 24 horas.
2. Para evitar a perfuração do esôfago, é importante para medir o comprimento da agulha gavagem para cada rato. Segure uma ponta de bola de 18g-agulha curvo gavagem na última costela do mouse, e depois marcar o comprimento da ponta da cabeça do rato usando um marcador permanente (ver vídeo). Durante a gavagem, a marca será um ponto de parada ao inserir a agulha na boca do mouse.
3. Contenha o mouse usando o aperto de mão mesmo que para uma injeção intraperitoneal. Inserir a agulha gavagem na boca, sobre a língua, e advance a agulha através da faringe. Não insira a agulha após a marca de parar. A agulha deve prosseguir sem problemas, sem qualquer tipo de pressão (ver vídeo). Se você encontrar a pressão, parar e retirar a agulha para evitar a injeção de fluidos nos pulmões.
4. Com a agulha no lugar, o êmbolo mais 1-5 segundos e depois retire a agulha no mesmo ângulo que foi inserido. Monitorar o mouse por 5-10 minutos, prestando muita atenção a qualquer sinal de dificuldade para respirar que pode indicar que o fluido tenha entrado no pulmão.

2. Entrega Local

Aguda Convecção-Enhanced Entrega

A. Construção da sonda

A cânula refluxo resistente CED para roedores ainda não é comercialmente disponível. Aqui vamos demonstrar um método para a construção de cânula que foi adaptado de um primeiro método descrito por Krauze et al (Krauze 2005).

• A cânula tem três partes (Figura 1): tubo de sílica 100um de diâmetro através do qual os fluxos infusato, uma agulha de metal rígido para o apoio estrutural e flexível tubo de Teflon para carregar o infusato.
• Para obter a agulha de metal rígido, use uma chama para derreter o plástico em um cateter IV Surflo (24g estilete) e usando uma pinça retire a agulha de metal. O resto do cateter pode ser descartada. Corte um pedaço de tubo de sílica (OD 0,163 milímetros), ligeiramente mais longo que a agulha de metal, utilizando uma lâmina de barbear única de ponta. Tubo de papel da sílica em uma pequena gota de cianoacrilato cola de ação rápida com base (por exemplo, Krazy Glue), tomando cuidado para não deixar nenhuma cola nas extremidades do tubo. Insira o tubo de sílica na agulha de metal e deixe secar por 5 minutos.
• Depois de seco, o tubo de sílica deve ser solidamente fixado sobre a agulha. As extremidades da sílica devem ser aparadas para que se projeta 2mm de sílica tubulação da extremidade pontiaguda da agulha e 3 milímetros de tubos de sílica se projeta a partir da extremidade plana (ver vídeo).
• Cortar uma seção de tubo de Teflon 20 cm de comprimento. Rolo da agulha de metal em uma pequena gota de cola, novamente tomando cuidado para não se cola nas extremidades do tubo de sílica como este vai obstruir a cânula. Inserir a agulha no tubo de Teflon a uma profundidade de 1cm. Deixe secar por 1 minuto. Usando uma pistola de cola, aplique uma gota de cola quente para a articulação entre a agulha de metal eo tubo de Teflon (ver vídeo). Assegurar que todo o conjunto é coberto por todos os lados e deixe secar por pelo menos 1 hora. Cânulas podem ser feitas até uma semana de antecedência e armazenado em temperatura ambiente.

B. Procedimento de Infusão

• Para preparar a área cirúrgica, as superfícies devem ser pulverizadas com um desinfectante, como uma solução de clorexidina a 2%. Luvas cirúrgicas estéreis, devem ser usados ​​durante o procedimento. As superfícies são então cobertas com cortinas absorventes. As fontes a seguir deve ser colocado na área cirúrgica:
  • Almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato
  • Duas pequenas placas de Petri, um contendo peróxido de hidrogênio 3% e uma contendo clorexidina a 2%
  • Swabs estéreis gaze e algodão
  • Bisturis descartáveis ​​estéreis (Número 21)
  • Estéreis as agulhas 22g
  • Rato estereotáxica quadro
  • Bomba de seringa taxa controlada
  • Autoclavado pele do rato grampeador, grampos, e removedor de grampos
• Para configurar a cânula CED, anexar uma seringa 1 ml para o tubo de Teflon usando um conjunto de adaptadores de seringa de plástico. A cânula deve ser afixada no quadro de estereotáxica para que seja perpendicular à superfície cirúrgica (ver vídeo). Para desinfetar a cânula, encha a seringa com 1 ml de etanol 70% e pressionar o êmbolo para executar o etanol através da cânula. Repita esse processo com solução salina estéril, e verificar se há algum vazamento em torno das articulações cânula. Para desinfetar a parte externa da cânula, limpe com um álcool 70% limpe.
• Preencher a cânula com solução salina estéril e, em seguida, puxe seringa de modo que uma pequena bolha de ar é atraído para a cânula. Esta bolha de ar vai separar o infusato da solução salina na cânula. Então, protelar o seu infusato (ver vídeo). Conectar a seringa à bomba de seringa e bombear o prime rodando por breves instantes, a cânula.
• Sedar o rato usando um anestésico injetado e preparar a pele limpando várias vezes (por 5-10 segundos) com um pedaço de gaze estéril embebida em solução de clorexidina a 2%. Pomada oftálmica deve ser aplicado o mouse para manter a umidade adequada durante o procedimento. Utilizando um escalpelo esterilizado, criar uma incisão sagital ao longo do centro do crânio, aproximadamente 1,5 cm de comprimento (ver vídeo). A superfície do crânio é então limpo com um cotonete embebido em uma solução de 3% de peróxido de hidrogênio. Tome cuidado para evitar o peróxido de hidrogênio nos olhos do mouse. Linhas de sutura do crânio deve ser aparente neste ponto: se eles não estiverem visíveis, gentilmente limpe o crânio com um fresh cotonete embebido em solução a 3% de peróxido de hidrogênio.
• Identificar o bregma (Figura 2) e em seguida medir dois milímetros para a direita e 1mm posterior desta estrutura para localizar o local de infusão. Usando a agulha estéril 22g, gentilmente criar um buraco no crânio, neste ponto, torcendo a agulha contra o crânio (ver vídeo). Evite forçar a agulha para baixo contra o crânio.
• Neste ponto, o mouse deve ser colocado na armação estereotáxica e começar a receber anestesia inalatória (ver vídeo). Administrar o anestésico em um nível baixo (1%), e acompanhar atentamente o mouse para mudanças na taxa de respiração, ajustando o anestésico em conformidade.
• Posição da cânula sobre o furo do crânio e abaixe 3 milímetros abaixo da superfície do crânio. Começar a infusão, utilizando as seguintes taxas e durações:

  0,1 mL / min por 5 minutos
  0,2 mL / min por 5 minutos
  0,5 mL / min por 5 minutos
  0,8 mL / min para 7,5 minutos
  OFF por 1 minuto

• No final da infusão, lentamente, remova a cânula e swab crânio com peróxido de hidrogênio 3%. Aplicar cera de osso estéril para o buraco (ver vídeo). Utilizando uma pinça, tirar a pele junto sobre o crânio e grampo para fechar. Buprenorfina deve ser administrada no pós-operatório alívio da dor.
• Monitorar o mouse no pós-operatório até que ele recobra a consciência e mobilidade. Devido à morosidade do processo, pode demorar até uma hora para o mouse para recuperar a plena atividade. Durante este tempo, lugar a gaiola do mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, e não a casa do rato recuperando com outros ratos ativo.
• Grampos de pele devem ser removidos uma semana após a cirurgia.

C. In Vivo de imagem

Infusato fluorescente-rotulados podem ser visualizados após a administração CED, e pode ser monitorado para mudanças na intensidade do sinal bem como a localização do sinal. Normalmente, é melhor esperar 2-3 horas após a infusão de imagem, de modo a permitir o mouse para se recuperar da infusão.

• Para anestesia durante o exame, use um baixo nível de um anestésico inalatório. Posicione o rato, o lado dorsal para cima, em uma estação de imagens (por exemplo, IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Usando uma configuração apropriada de filtro para o fluor que está sendo fotografada, adquirir uma imagem. Para CED, uma infusão bem-sucedido deve mostrar a maioria do material no cérebro perto do local de perfusão (Figura 3).

3. Resultados representante

A falta de reação adversa a administração da terapia é um importante indicador da injeção de sucesso. Por exemplo, após a injeção das veias da cauda não deve haver mudança na aparência (por exemplo, tamanho, cor) da cauda. Uma bolha ou blister a seguir à injecção veia da cauda indicaria subcutânea, em vez de entrega, por via intravenosa de terapia. Para injeções intraperitoneal, uma colisão na pele ou descoloração do abdómen pode indicar a injeção subcutânea ou danos a estruturas internas. Em gavagem oral, um mouse com dificuldade para respirar ou tossir pode indicar que o líquido era injetado para dentro dos pulmões, ao invés de para o estômago.

Para CED, a função neurológica é importante para avaliar a administração de sucesso da terapia. Um rato que está apresentando convulsões ou hemiparesia pode ter recebido uma infusão impróprio. Se um infusato fluorescente é utilizado, in vivo de imagens pode ser aplicado para avaliar a administração bem sucedida (Figura 3). Se o infusato não está localizada no local da injeção, a perfusão não foi bem sucedida.

Figura 1: Cânula CED e Cirúrgica Set-up. Os elementos básicos da entrega de convecção-enhanced cirúrgica set-up são mostrados. Uma bomba microinfusion (A) é acoplada a uma cânula de infusão (B, em tamanho ampliado no topo). Uma moldura estereotáxica (C) é usado para posicionar a sonda. Esta imagem não inclui equipamento de aquecimento e anestésico usado também durante o procedimento.

Figura 2: Linhas de rato Suture Caveira. O local de infusão CED (estrela vermelha) podem ser localizados através da identificação da intersecção das suturas sagital e coronal (o bregma) e medindo 2 milímetros lateral e um milímetros posterior do bregma.

Figura 3: Resultados Representante do CED sucesso. Liposomes marcado com um corante vermelho-distante fluorescentes foram infundidas no cérebro de camundongos pelo CED e fotografado in vivo e ex vivo. A infusão de sucesso mostra um sinal fluorescente localizada no local da perfusão tanto in vivo (A) e ex vivo (B). O sinal deve ser localizada no hemisfério infundida sem fuga para o hemisfério contralateral.

Figura 4: Imagem Representante do CED sucesso no tronco cerebral de ratos. Lipossomas fluorescente-marcadas foram infundidas no tronco cerebral de ratos. Em ratos, tanto quanto 20μL pode ser infundido. O aumento da espessura do crânio de ratos e profundidade de injeção in vivo impedido de imagem, mas a localização de infusão correta pode ser verificada por meio de imagens ex vivo do cérebro dissecado.

Discussion

Avaliação pré-clínica da eficácia de qualquer agente terapêutico deve levar em conta as propriedades farmacológicas do agente e do tecido alvo de interesse. Enquanto os métodos de administração sistêmica são em geral mais fácil e melhor tolerada pelos pacientes, a seletividade da barreira hemato-encefálica, muitas vezes necessita de local de entrega da terapia para o tratamento da doença do SNC. Aqui, nós demonstramos um método de entrega direta para o cérebro: CED. Outras formas de entrega local para o cérebro incluem a administração direta com o líquido cefalorraquidiano, a injeção intratumoral bolus, e injeção ventricular. Para estes métodos, difusibilidade de terapêutica é extremamente importante, com difusão de pobres limitar a região de cobertura a alguns milímetros do local da injeção (Jain 1989, Bobo, 1994). Em contraste, CED usa pressão positiva para aumentar a área de distribuição de drogas (Bobo 1994), enquanto ainda permitindo que o alvo para terapêutica específica estruturas neuroanatômicas. Em nosso laboratório, conseguimos CED realizada no tronco cerebral, bem como para o putâmen caudado em roedores (Figura 4).

A habilidade de conduzir CED em modelos de roedores tem se tornado cada vez mais importante na associação com crescente interesse em maximizar a eficácia terapêutica no tratamento de vários tipos de doença do SNC. CED pode ser usada para fornecer uma variedade de agentes, incluindo proteínas purificadas, medicamentos de pequenas moléculas e vírus (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007). A gama de doenças que podem ser tratados com CED inclui cânceres do SNC (Yamashita 2007), bem como doenças neurodegenerativas, como doença de Parkinson (Gill, 2003). Como a pesquisa CED continua a se expandir, a necessidade de em imagens in vivo da terapia administrada CED é igualmente crescente. Enquanto a imagem fluorescente demonstrado aqui, provavelmente não será visível através do crânio humano, outros métodos que empregam co-infusão de agentes de contraste MRI (Dickinson 2008) estão atraindo o interesse para avaliar a aplicabilidade para o monitoramento infusatos em pacientes com doença do SNC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine	Fisher Scientific	NC9756995	AKA Nolvasan”
20g Needle	BD Biosciences	305175
28g Needle (with syringe)	Fisher Scientific	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs	Fisher Scientific	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive	Fisher Scientific	NC9592632	AKA Krazy Glue”
Disposable Scalpels	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No. 21
Gauze	Fisher Scientific	22028563	Autoclave before use
Heating Pad	Dunlap	HP950
I.V. Catheter	Fisher Scientific	14-841-20
Infusion Pump	BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software	Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment	Cardinal Health	1272830	AKA Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors	Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing	Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover	Stoelting Co.	59020
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.	51725
Teflon Tubing	Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Contact for Quote