全身和局部给药治疗的中枢神经系统疾病的啮齿动物模型

Summary

彻底在中枢神经系统的药物，临床前试验，往往涉及的评估和比较药物体内分布与管理的具体路线协会。在这里，三个系统性交付的常用方法（静脉，腹腔，口腔），以及为本地传递方法（对流增强交付）在小鼠体内证明。

Abstract

彻底的中枢神经系统（CNS）的临床前试验的疗法包括在评估疗效时考虑的管理和代理生物分布的路线。两者之间的主要分类管理，本地与系统性，全身交付方法往往是首选由于易于管理。然而，全身交付可能会导致不理想的药物浓度在中枢神经系统实现，并导致错误结论，关于代理疗效。局部给药方法更具侵入性的，但可能是必要的，以达到治疗中枢神经系统的药物浓度。在这里，我们表现出适当的技术，为全身给药途径：静脉注射，腹腔注射，灌胃。此外，我们为本地传递到大脑的方法：对流增强交付（CED）。使用荧光标记的化合物在体内成像和适当的药品监督管理局核查。使用小鼠模型的方法，但是，可以很容易地使用大鼠适应。

Protocol

1。全身给药方法

虽然药物的全身交付是不是最有效的方法，为实现在中枢神经系统的药物浓度高，全身交付方便，深受患者所接受。在这里，我们将展示适当的程序，三个经常使用的全身给药方法：静脉注射，腹腔注射，灌胃。

A.静脉注射（尾静脉注射）

1. 在程序开始之前，每只小鼠的体重应记录在案。与所有的临床前研究，应定期监测体重（每周两次或更大），以评估潜在的药物毒性。鼠标的体积体重不超过1％，应注射在一个单一的时间。例如，流体不超过悬液0.2ml应注射在20克鼠标。所有静脉注射液应通过适当的方法消毒。
2. 鼠标应使用加热垫或加热灯的尾静脉扩张5-10分钟的热身。如果使用烤灯，监视鼠标在任何时候，以避免热疗。
3. 鼠标被转移到一个装置，抑制鼠标，同时允许访问尾静脉（见视频）。在鼠标尾部有四个可见的船只上背部和侧面的船只的静脉和船只上的腹侧方动脉。要访问的尾静脉，鼠标的尾部是最远端点举行，90度旋转，因此，静脉朝上。注射部位用酒精棉签清洁和一个28克胰岛素注射器，斜面端插入静脉，（见视频）。如果放置在静脉针是正确的，应该自由移动，没有压力。压力甚至超过5-10秒，慢慢注入药物。如果尾巴上出现水泡，停止注射，因为这表明不再是在静脉针。
4. 注射后，注射部位轻轻推压，直到出血停止。这通常需要30-60秒。监视器的小鼠在注射后5-10分钟，以确保没有再出血。

B.腹腔注射

1. 开始前注射，药物应装入一个28克针注射器。确保有空间注射器注射前柱塞（例如，如果注射200μL，确保注射器容量为300μL或更大）。
2. 从笼中取出鼠标，它的尾巴和它放到特定的材质表面，使鼠标握的东西。一笼盖通常是足够的。允许鼠标伸展它的身体，然后使用你的非惯用手，掌握鼠标的背部皮肤，轻轻捏你的拇指和食指和中指（见视频）之间尽可能皮肤照顾。翻转鼠标，使鼠标的腹部朝上。如果鼠标可以随意移动它的头，松开握，然后再试一次，这样才能避免在注射咬伤。
3. 随着你的惯用手，拿起注射器和针插入一个30度角进入下鼠标左键象限（见视频）。按住鼠标稍微倒将有助于推动机关，远离注射部位。为了确保针在腹腔内的空间，拉回注射器推杆。如果任何液体或血液在注射器中出现，然后针在腹腔内的空间，应予删除。如果没有液体注射器吸气，然后注入注射器内容与均匀的压力超过1-5秒，然后释放鼠标。
4. 监视器的小鼠在注射后5-10分钟，以确保鼠标返回到正常活动水平。

C.灌胃

1. 开始注射之前，记录鼠标的重量。灌胃，可交付的最大音量是每公斤体重10毫升。例如，为20克鼠标的最大音量将200μL。试图注入更大的卷可能会导致回流，这将导致不完整的药物输送。管理卷大于上述表示如果有必要，多达三个剂量可能超过24小时的管理。
2. 为了避免刺破食道，重要的是要测量每只小鼠灌胃针的长度。按住鼠标的最后一根肋骨弯曲灌胃针18G球尖，然后标记在鼠标的头部使用永久性标记（见视频）提示长度。在灌胃，这个标志将被停止点鼠标口针插入。
3. 使用相同的把手为腹腔注射抑制小鼠。灌胃针插入嘴里，在舌头，ADVANCE通过咽针。过去的停止标志，不要插入针。针应进行顺利，没有任何压力（见视频）。如果您遇到的压力，停止并退出针头，以避免进入肺部注射液。
4. 针到位，压低柱塞超过1-5秒，然后取出针插入，这是在同一角度。显示器鼠标5-10分钟，密切关注的任何迹象，这可能表明，液体进入肺部的呼吸困难。

2。本地传递

急性对流增强交付

A.探头建设

耐回流老鼠CED导管尚未投放市场。在这里，我们将演示一个Krauze等人（2005年Krauze）首次描述了一个方法，是从适应的套管施工方法。

• 套管三部分组成（ 图1）：直径100um的石英管，通过它infusate流动，为结构支撑的刚性金属针，和灵活的聚四氟乙烯管加载的infusate 。
• 为了获得刚性的金属针，使用明火融化的塑料上Surflo静脉导管（24克钢丝），并用小镊子取出金属针。其余的导管可以被丢弃。切割长度的石英管（外径0.163毫米），比金属针，用单刃刀片。作用在氰基丙烯酸酯为基础的快速胶（如Krazy胶）小降硅管，照顾没有得到任何油管两端的胶水。在金属针插入石英管，并让干燥5分钟。
• 一旦干燥，石英管应紧紧贴针。二氧化硅的两端应修剪，使石英管伸出针和3mm的石英管伸出从平坦的（见视频）指出为2mm。
• 剪切特氟隆管20厘米长的一节。轧辊的金属针，在小降的胶粘剂，再照顾，不要让石英管两端的胶水，因为这会堵塞套管。针插入深度为1cm的特氟隆管。 1分钟，让干燥。使用胶枪，热熔胶应用金属针和聚四氟乙烯管（见视频）之间的联合下降。确保各方覆盖整个关节，让至少1小时的干燥。长达一个星期的套管可以预先在室温下储存。

B.输液过程

• 为了准备手术区，所有表面应喷洒消毒剂，如2％洗必泰溶液。在手术过程中，应穿着无菌手术手套。表面再铺上吸水窗帘。在手术区应放在以下耗材：
  • 加热垫，以保持鼠标体温
  • 两个小培养皿;一个含有3％的双氧水，和一个含有2％洗必泰
  • 无菌纱布和棉签
  • 无菌一次性手术刀（21号）
  • 无菌22克针
  • 鼠标立体框架
  • 控制的速率注射泵
  • 蒸压小鼠皮肤订书机，订书钉，起钉器
• 要设置海关套管，附加1ml注射器特氟隆管，用塑料注射器适配器。套管应贴的立体框架，使其垂直于表面手术（见视频）。消毒套管，填充70％的乙醇1ml注射器和压低柱塞通过套管运行的乙醇。使用无菌生理盐水，重复这一过程，并检查左右的套管接头有无渗漏。消毒导管外，70％的乙醇擦拭轻轻擦拭。
• 用无菌生理盐水填充套管和再拉回来，使注射器套管绘制一个小气泡进入。这个气泡会在导管生理盐水分开的infusate。然后，回程infusate（见视频）。简要运行导管连接到注射器注射泵泵和总理。
• 稳重鼠标使用注射麻醉剂，并准备用一块无菌纱布擦拭数次（5-10秒）皮肤浸在2％洗必泰溶液。眼药膏应适用的鼠标，在手术过程中保持充足的水分。用消毒的手术刀，沿着头骨中心创建一个矢状切口，约1.5厘米长（见视频）。头骨表面，然后用棉签在3％的双氧水溶液浸泡清洗。小心避免鼠标的眼睛越来越双氧水。头骨的缝合线应体现在这一点：如果它们是不可见的，轻轻拭与FR的头骨ESH棉签在3％的双氧水溶液浸泡。
• 确定前囟门（ 图2），然后测量2mm到的权利和1mm这种结构后找到输液部位。使用无菌22克针，轻轻扭针对头骨（见视频）在这一点上创建一个洞的头骨。避免强迫针向下对头骨。
• 此时，鼠标应放置在立体框架，并开始接受吸入麻醉药（见视频）。管理处于较低的水平（1％）的麻醉，并仔细监视鼠标呼吸速率的变化，相应调整了麻醉。
• 在骷髅洞的套管，然后降低3mm的颅骨表面下的位置。开始输液，使用下面的利率和期限：

  0.1μL/分钟5分钟
  0.2μL/分钟5分钟
  0.5μL/分钟5分钟
  0.8微升/分钟7.5分钟
  关闭1分钟

• 在输液结束时，慢慢取出套管和棉签用3％过氧化氢的头骨。应用无菌骨蜡孔（见视频）。使用镊子，共同绘制皮肤在颅骨和主食关闭。丁丙诺啡应管理手术后的疼痛缓解。
• 手术后监视鼠标，直到它恢复意识和流动。由于程序的长度，它可能需要鼠标一个小时重新获得充分的活动。在加热垫的鼠笼，在这段时间内，以避免体温过低，并没有房子与其他活跃小鼠恢复鼠标。
• 手术后一周皮肤订书钉应删除。

C. 在活体成像

infusate荧光标记，可以成像，海关管理，并可以监测信号强度的变化，以及信号的位置。通常情况下，最好是等待2-3小时后，输液的形象，从而使鼠标恢复输液。

• 对于麻醉期间成像，使用吸入麻醉剂的低水平。鼠标的位置，背侧成像站，（例如，IVIS Lumina的，卡尺生命科学，阿拉米达，加州）。使用适当的过滤器设置的福陆公司是成像，获取的图像。对于海关，一个成功的输液应显示大部分的物质在大脑附近输液部位（ 图3）。

3。代表性的成果

缺乏不良反应的治疗管理是一个成功的注射的重要指标。例如，尾静脉注射后在外观上不应该有变化的尾巴（例如，大小，颜色）。一个气泡或水泡，尾静脉注射后表示皮下，而不是静脉注射，治疗交付。腹腔注射，腹部的皮肤上或变色的撞击可能表明皮下注射或损坏内部结构。在灌胃，用鼠标吃力，呼吸或咳嗽，可能表明，流体注入肺部，而不是进肚子里，。

对于海关，神经功能评估治疗成功的管理是非常重要的。可能已收到参展癫痫或偏瘫的鼠标，是不适当的输液。如果使用一种荧光infusate， 在活体成像，可用于评估成功的管理（ 图3） 。如果infusate是不是局部注射部位，输液没有成功。

图1：土木工程署的套管和手术设置。对流增强交付手术的基本要素设置显示。一个microinfusion泵（A）是连接到输液导管，（二，显示在顶部扩大）。一个立体的框架（C）是用来定位的探针。此映像不包括取暖​​，并在手术过程中使用的麻醉设备。

图2：鼠标颅骨缝合线。土木工程署输液部位（红星），可以找到确定的矢状面和冠状缝合线的交点（前囟门），然后测量2毫米横向和1mm的前囟后。

图3：成功的土木工程署的代表结果。李由土木工程署与远红光的荧光染料标记posomes注入老鼠大脑，并在体内和体外成像。一个成功的输液显示了本地化，无论是在体内（A） 和体外（二）输液部位的荧光信号。信号应无泄漏到对侧大脑半球局部注入半球。

图4：成鼠脑干成功土木工程署的形象代表。荧光标记的脂质体注入大鼠脑干。在大鼠中，尽可能多20μL注入。可以核实体外解剖脑成像大鼠颅骨和排除体内成像注射的深度，但正确的输液位置增加厚度。

Discussion

任何治疗药物的疗效的临床前评价必须考虑到代理的药理特性和利益的目标组织。虽然系统性的管理方法，一般是更轻便和​​患者的耐受性更好，血 - 脑屏障的选择性，往往需要地方交付用于治疗中枢神经系统疾病的治疗。在这里，我们已经证明大脑：海关直接配送的方法之一。本地传递到大脑的其他形式包括直接管理到脑脊液，瘤内推注，并脑室注射。对于这些方法，治疗扩散性是极为重要的，差扩散的限制，覆盖区域从注射部位（耆那教的1989年，1994年波波）几毫米。相比之下，土木工程署使用正压，以增加药物分布（1994年波波）的领域，同时还使治疗针对特定的神经解剖结构。在我们的实验室，我们已经成功地执行海关到脑干，以及为在啮齿类动物的尾壳（图 4 ）。

协会的能力，在啮齿类动物模型进行海关已成为越来越重要的最大限度地提高疗效，在治疗中枢神经系统疾病的各类时，越来越感兴趣。海关可用于提供各种代理人，包括纯化蛋白质，小分子药物，和病毒（吉尔2003年，德劲2003年，Szerlip 2007年）。与海关可以治疗的疾病范围包括中枢神经系统的癌症（山下2007年），以及神经退行性疾病，如帕金森氏症（2003年吉尔）。由于土木工程署研究的不断扩大，需要在海关管理治疗的活体成像，也同样增加。虽然荧光成像表明这里可能会无法通过人类头骨可见，用人合作造影剂灌注（迪金逊2008）等方法吸引兴趣的适用性评估监测中枢神经系统疾病患者infusates。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Chlorhexidine	Fisher Scientific	NC9756995	AKA Nolvasan”
20g Needle	BD Biosciences	305175
28g Needle (with syringe)	Fisher Scientific	22-004-270	AKA Insulin Syringe
3% Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H312P-4	Store away from light
Cotton Swabs	Fisher Scientific	23-400-100	Autoclave before use
Cyanoacrylate-based Adhesive	Fisher Scientific	NC9592632	AKA Krazy Glue”
Disposable Scalpels	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No. 21
Gauze	Fisher Scientific	22028563	Autoclave before use
Heating Pad	Dunlap	HP950
I.V. Catheter	Fisher Scientific	14-841-20
Infusion Pump	BASi	MD-1000, MD-1001
Living Image Software	Caliper Life Sciences	Contact for Quote
Ophthalmic Ointment	Cardinal Health	1272830	AKA Akwa Tears”
Plastic Syringe Adaptors	Upchurch Scientific	P-604, P-200NX, P-215X, P-630	Fits on Luer Lock Syringes
Silica Tubing	Polymicro Technologies	2000020
Skin Stapler, Staples, Remover	Stoelting Co.	59020
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.	51725
Teflon Tubing	Upchurch Scientific	1520
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Contact for Quote