Summary
Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.
Abstract
Tumormodelle sind entscheidend für die präklinische Testung von Hirntumoren im Hinblick auf die Erforschung neuer, wirksamerer Behandlungen. Angesichts des großen Interesses an der Immuntherapie ist es umso wichtiger, ein konsistentes, klinisch relevantes, immunkompetentes Mausmodell zu haben, um die Tumor- und Immunzellpopulationen im Gehirn und ihr Ansprechen auf die Behandlung zu untersuchen. Während die meisten präklinischen Modelle die orthotope Transplantation etablierter Tumorzelllinien verwenden, ermöglicht das hier vorgestellte Modellierungssystem eine "personalisierte" Darstellung patientenspezifischer Tumormutationen in einer allmählichen, aber effektiven Entwicklung aus DNA-Konstrukten, die in sich teilende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) in vivo eingefügt werden. DNA-Konstrukte verfügen über die Mosaikanalyse mit der Dual-Recombinase-vermittelten Kassettenaustauschmethode (MADR), die eine somatische Mutagenese von Treibermutationen in Einzelkopie ermöglicht. Bei neugeborenen Mäusewelpen zwischen der Geburt und dem Alter von 3 Tagen werden NPCs gezielt angesprochen, indem sie sich diese sich teilenden Zellen zunutze machen, die die Seitenventrikel auskleiden. Nach der Mikroinjektion von DNA-Plasmiden (z. B. MADR-abgeleitet, Transposons, CRISPR-gerichtete sgRNA) in die Ventrikel folgt die Elektroporation mit Paddeln, die die rostrale Region des Kopfes umgeben. Bei elektrischer Stimulation wird die DNA in die sich teilenden Zellen aufgenommen, mit dem Potenzial, sich in das Genom zu integrieren. Der Einsatz dieser Methode wurde sowohl bei der Entwicklung von pädiatrischen als auch bei erwachsenen Hirntumoren, einschließlich des häufigsten bösartigen Hirntumors, des Glioblastoms, erfolgreich nachgewiesen. Dieser Artikel diskutiert und demonstriert die verschiedenen Schritte der Entwicklung eines Hirntumormodells mit dieser Technik, einschließlich des Verfahrens der Anästhesie junger Mäusejungtiere bis hin zur Mikroinjektion der Plasmidmischung, gefolgt von der Elektroporation. Mit diesem autochthonen, immunkompetenten Mausmodell werden die Forscher in der Lage sein, präklinische Modellierungsansätze zu erweitern, um die Wirksamkeit der Krebsbehandlung zu verbessern und zu untersuchen.
Introduction
Maus-Hirntumormodelle sind entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Entstehung und Behandlung von Hirntumoren. Derzeitige Modelle umfassen in der Regel schnell hergestellte subkutane oder orthotope Transplantationen häufig verwendeter Tumorzelllinien, die auf einer begrenzten Anzahl von Treibermutationen oder von Patienten abgeleiteten Xenotransplantatmodellen basieren, wobei immundefiziente Mäuse verwendet werden, die geeignete Immuntherapiestudien behindern 1,2,3,4. Darüber hinaus können diese präklinischen Ergebnisse zu falsch positiven Ergebnissen führen, da solche Modelle dramatische, oft heilende Effekte als Reaktion auf die Therapie aufweisen können, was sich jedoch nicht auf die Klinik übertragen lässt 2,5,6,7. Die Fähigkeit, schnell gentechnisch veränderte präklinische Mausmodelle herzustellen, die die Mutationssignaturen der Patienten besser widerspiegeln, ist unerlässlich, um die Validität präklinischer Ergebnisse zu verbessern.
Die auf Elektroporation (EP) basierende Verabreichung von DNA-Plasmiden, die sowohl Funktionsverlust- (LOF) als auch Funktionsverstärkungsmutationen (GOF) induzieren, ermöglicht die Generierung solcher Modelle. Wir haben eine Methode für eine noch genauere Darstellung von GOF-Treibermutationen entwickelt, die Mosaikanalyse mit dualem Rekombinase-vermitteltem Kassettenaustausch, kurz MADR8. Dieses Verfahren ermöglicht die Expression eines Gens (oder von Genen) von Interesse in einer kontrollierten, locusspezifischen Weise in somatischen Zellen8. In Kombination mit anderen molekularen Werkzeugen, wie z.B. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), können verschiedene Patientenmutationen kombiniert werden, um Hirntumormodelle für Mäuse zu entwickeln. Diese Methode wurde bei verschiedenen pädiatrischen Hirntumoren, darunter Gliome und Ependymome8, sowie bei erwachsenen Hirntumormodellen wie dem Glioblastom (GBM) eingesetzt.
Während die EP-Methode der Tumormodellierung nicht so verbreitet ist wie eine Transplantation, zeigt das Folgende die Einfachheit und hohe Reproduzierbarkeit dieses Modellierungssystems. mTmG-Mäuse werden für die Insertion der MADR-Plasmid-DNA 8,9 verwendet. Dieses System ermöglicht die Rekombination von loxP- und Flp-Rekombinase-Zielstellen (FRT), die sich am Rosa26-Locus befinden, für die anschließende Insertion des DNA-Plasmids des Spenders (d. h. des GOF-Gens von Interesse)8,9. Das folgende Protokoll demonstriert die Einfachheit dieser Methode nach sorgfältigem Üben und die Fähigkeit, Hirntumormodelle von Mäusen auf autochthone, konsistente Weise zu entwickeln.
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Protocol
Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden vom Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Homozygote mTmG-Mäuse wurden mit C57BL/6J-Mäusen gezüchtet, um Würfe von gemischtgeschlechtlichen, heterozygoten mTmG-Mäusen für die Verwendung im folgenden Protokoll zu erhalten. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Jungtiere der Mäuse wurden zwischen dem 0. und 3. Tag nach der Geburt elektroporiert (P0-P3).
1. Chirurgischer Aufbau
- Den OP-Tisch mit chemischem Desinfektionsmittel (z. B. Vimoba) einsprühen und abwischen, gefolgt von 70%igem Ethanol, und wieder abwischen.
- Legen Sie die folgenden Instrumente/Materialien auf den Operationstisch: gezogene Glaskapillarpipetten (siehe Referenz10 zum Ziehen von Pipetten), kleine Scheren, kleine Behälter für scharfe Gegenstände mit biologischen Gefahren, Mikroliterpipetten und Pipettenspitzen, 2x geschnittene quadratische Stücke Paraffinfolie, Elektrodengel, Elektroden, Halterung für den Mikroinjektor und DNA-Plasmidmischung (siehe Materialtabelle und Zusatzdatei 1).
- Platzieren Sie die folgenden Aufsätze auf dem Gerät auf dem Operationstisch oder auf dem Boden, wenn dies angezeigt ist: Mikroinjektor-Bedienfeld, Halterung und Stecker, die an der Maschine befestigt sind, Ständer zum Halten des Mikroinjektorhalters an der Seite (Löthilfe), Mikroinjektor-Fußpedal (auf dem Boden), Elektroden, die an der Maschine befestigt sind, und Elektrodenfußpedal (auf dem Boden) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das Elektroden-Fußpedal wurde rechts neben dem Mikroinjektor-Fußpedal angebracht, um an die Reihenfolge der Verwendung zu erinnern. - Schalten Sie die Bedienfelder für Mikroinjektoren und Elektroden ein.
- Überprüfen Sie, ob die Einstellungen am Mikroinjektor für das Experiment korrekt sind: Der Druck muss zwischen 220 und 450 hPa liegen, je nachdem, wie das Plasmidgemisch aufgenommen wird.
- Überprüfen Sie, ob die Einstellungen auf dem Elektrodenfeld für das Experiment korrekt sind.
ANMERKUNG: Für das aktuelle Experiment (und die meisten unserer Hirntumormodelle) werden fünf Pulse von 120 V (50 ms; im Abstand von 950 ms) verwendet.
2. Präoperative Vorbereitung
- Bereiten Sie die Plasmidmischung im Mikroinjektor vor.
- Entnehmen Sie eine gezogene Glaskapillarpipette und führen Sie sie in den Mikroinjektorhalter ein. Stellen Sie sicher, dass die Spitze angeschraubt ist, um sie an Ort und Stelle zu halten.
- Halten Sie den Mikroinjektorhalter in der einen Hand und die kleine Schere in der anderen Hand; Halten Sie die Spitze der Pipette über einen kleinen Behälter für scharfe und scharfe Gegenstände. Drücken Sie bei geschlossener Schere leicht auf die verlängerte Glaskapillarpipette. Schneiden Sie an der Stelle, an der die Biegung zu sehen ist, ca. 2 mm von der Öffnung entfernt. Wenn der Schnitt gelungen ist, vorsichtig zur Seite legen.
- Legen Sie das handelsübliche Plasmid-Mischröhrchen flach auf den Operationstisch und öffnen Sie es. Bewahren Sie die Pipettenspitzenbox oder einen anderen Gegenstand hinter dem Boden des Röhrchens auf, um sie beim Aufziehen der Plasmidmischung stabil zu halten. Legen Sie die Glaspipette, die an der Mikroinjektorleitung befestigt ist, flach auf den Tisch und führen Sie sie vorsichtig in das Röhrchen der Plasmidmischung ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Spitze in der Nähe des Bodens des Röhrchens gut in der Mischung steckt.
HINWEIS: Aufgrund der natürlichen Schwerkraftabsaugung beginnt die Absaugung der Plasmidmischung in der Glaspipette, bevor sie aktiv eingezogen wird. - Verwenden Sie mit der Spitze der Glaspipette in der Plasmidmischung die Mikroinjektorplatte, um die angesaugte Menge zu erhöhen. Beginnen Sie bei 0, drehen Sie den rechten Knopf und drehen Sie in die negative Richtung in Richtung -60 - dies bringt die Plasmidmischung in die Glaspipette. Bringen Sie nur ~1 Zoll Plasmidmischung ein. Drehen Sie den Knopf wieder auf 0 und nehmen Sie dann die Pipettenspitze aus der Mischung.
HINWEIS: Entfernen Sie die Pipettenspitze nicht aus der Mischung, während Sie sich in negativer Richtung befinden, da dies die Mischung in den Mikroinjektor und möglicherweise in den Schlauch schießt. - Testen Sie die Menge der Mischung in einer Injektion, indem Sie die Mischung auf einen Streifen Paraffinfolie injizieren. Verwenden Sie das Fußpedal und drücken Sie einmal, um die Mischung auf den Paraffinfilm zu injizieren. Verwenden Sie die Pipette, die auf 1 μl eingestellt ist, um die Mischung auf dem Paraffinfilm aufzunehmen, um zu sehen, ob es genau 1 μl ist.
HINWEIS: Wenn er etwas weniger als 1 μl beträgt, kann der Druck des Mikroinjektors erhöht werden. Wenn sich der Druck 450 hPa nähert und immer noch weniger als 1 μl beträgt, ist die Glaspipettenöffnung zu klein und muss stärker gekürzt werden. Es wird empfohlen, die Plasmidmischung vor dem Trimmen wieder in das Röhrchen zu geben. Trotzdem bleibt eine Restmischung auf der Schere, daher ist es zwingend erforderlich, die Schere anschließend gründlich mit DNase zu reinigen, um die Restmischung zu entfernen. Wenn die Injektion mehr als 1 μl beträgt, muss eine neue gezogene Glaspipette verwendet und getrimmt werden. Wenn die Testmenge genau 1 μl beträgt, hat die Glaspipettenspitze die richtige Größe. - Wiederholen Sie Schritt 2.1.4, um eine zusätzliche Plasmidmischung für das Verfahren oder etwa 2-3 Zoll in die gezogene Glaspipette einzuziehen. Achten Sie darauf, dass die Mischung nicht zu weit in den Mikroinjektor eindringt, wo man das Ende nicht sehen kann.
HINWEIS: Beim Einziehen der Plasmidmischung ist es wichtig, Luftblasen zu vermeiden. Wenn Blasen vorhanden sind, ist es notwendig, diesen Schritt zu wiederholen, indem die Plasmidmischung aus der gezogenen Glaspipette entfernt und von vorne begonnen wird. Vorhandene Luftblasen wirken sich nachteilig auf die folgenden Schritte aus, wenn sie in die Herzkammer des Welpen injiziert werden. - Wenn die Plasmidmischung in der gezogenen Glaspipette bereit ist, legen Sie die vorbereitete Pipette seitlich auf den Löthilfsmittelständer und aus dem Weg, um sie nicht versehentlich zu berühren/zu stoßen.
- Bereiten Sie die Tiere auf den Versuch vor.
- Bereiten Sie einen Eiskübel für die Betäubung von Welpen vor. Geben Sie Wasser in den Eiskübel, um ihn zu schmelzen und den Anästhesiehalter (z. B. Pipettenkastenoberseite) zu kühlen.
- Legen Sie den Deckel der Box zum Abkühlen auf das geschmolzene Eis.
- Nehmen Sie die Welpen vorsichtig aus dem Käfig und legen Sie sie in die gekühlte Box, die auf dem Eis verbleibt. Lege eine weitere Oberseite locker über die Unterseite, um den Abkühlprozess zu unterstützen.
- Nach 2-3 Minuten nach den Welpen sehen. Trennen Sie die Welpen voneinander, während Sie in der Bauchlage bleiben.
HINWEIS: Die Welpen zappeln, aber das verlangsamt sich, wenn die kalte Anästhesie einsetzt. Der Kastendeckel kann weggelassen werden, um die Welpen gut sehen zu können. - Um die richtige Anästhesie zu überprüfen, kneifen Sie den Schwanz des Welpen und suchen Sie nach einer Reaktion. Wenn es eine Reaktion gibt, wiederholen Sie Schritt 2.2.4. Wenn kein Quietschen oder eine kleine Bewegung erfolgt, ist der Welpe bereit für den Eingriff.
HINWEIS: Mäuse sollten nicht über einen längeren Zeitraum auf Eis gehalten werden, da dies ihre Fähigkeit beeinträchtigt, sich nach dem Eingriff zu erholen. Nur die Anzahl der Welpen, die unter Narkose sowohl injiziert als auch elektroporiert werden können, muss auf Eis gelegt werden. Größere Zahlen können mit Erfahrung erreicht werden.
3. Mikroinjektion einer DNA-Plasmidmischung in die Hirnkammer
- Legen Sie einen Welpen in Bauchposition auf den Tisch.
- Ziehen Sie den Hinterkopf leicht zurück, um die Schädelnähte durch die Haut sichtbar zu machen. Finde Lambda auf dem Schädel. Die Herzkammer/Injektionsstelle befindet sich auf halbem Weg zwischen Lambda und Auge.
HINWEIS: Lambda ist der Punkt, an dem sich die sagittale und die lambdoide Naht schneiden. Siehe Referenz11 für die Identifizierung von Lambda auf dem Mäuseschädel. - Durchstechen Sie die Haut mit der Glaspipettenspitze in einem senkrechten Winkel (die Pipette ist gerade nach oben zur Decke). Achten Sie auf eine leichte konkave Einkerbung beim Druck auf den Schädel und einen anfänglichen Widerstand. Nach dem Durchstechen und dem Stechen der Glaspipettenspitze durch die konkave Vertiefung wird das entsprechende Injektionsniveau erreicht.
- Halten Sie die Glaspipettenspitze fest und drücken Sie einmal auf das Fußpedal des Mikroinjektors, um 1 μl der Plasmidmischung zu injizieren.
HINWEIS: Es gibt zwei Möglichkeiten, um deutlich zu sehen, dass die Injektion erfolgreich war. Lassen Sie zunächst ein anderes Labormitglied beobachten, wie die Plasmidmischung während der Injektion in der Glaspipette nach unten geht. Auch bei Verwendung von schnellem Grün oder einem anderen Farbstoff in der Plasmidmischung verteilt sich der Farbstoff nach der Injektion sichtbar in der Herzkammer unter der Haut und ist leicht sichtbar, wenn er an eine chirurgische Lampe gehalten wird.
4. Elektroporation
- Legen Sie ein Stück Paraffinfolie (ein Quadrat) auf den Tisch und drücken Sie das Elektrodengel auf der Folie aus. Bedecken Sie die Elektrodenpaddel mit Elektrodengel, indem Sie eine großzügige Menge auf jedes Paddel auftragen. Überschüssiges Gel, das abtropft, kann auf einem Papiertuch abgewischt werden.
HINWEIS: Lassen Sie nach der ersten EP das Gel von jedem Paddel nicht die andere Seite berühren. Dadurch wird die Ladung übertragen und beim Auftragen auf den Kopf des Welpen kann ein zischendes Geräusch zu hören sein. Dies geschieht auch, wenn das Gel auf dem Kopf des Welpen von einer Elektrode mit dem Gel einer anderen Elektrode in Kontakt kommt.
VORSICHT: Es muss darauf geachtet werden, dass die Finger während der Elektroporation von den Paddeln ferngehalten werden. - Halten Sie den Körper des Welpen in einer Hand (normalerweise die nicht-dominante Hand) und halten Sie die Finger weit hinter dem Kopf.
HINWEIS: Wenn Sie Rechtshänder sind, ist es am einfachsten, den Welpen mit der linken Hand und die Elektroden mit der rechten Hand zu halten. Wenn Sie Linkshänder sind, machen Sie das Gegenteil. - Bringen Sie die Elektroden in die Nähe des Kopfes des Welpen, um sicherzustellen, dass sie sich in der richtigen Position befinden, wobei sich die positive Elektrode an der Außenseite des Kopfes befindet, wo der Ventrikel anvisiert wird (z. B. wenn Sie auf die linke Herzkammer abzielen, platzieren Sie die positive auf der linken Seite des Welpen und die negative auf der rechten Seite des Welpen). Während Sie die Elektroden positionieren, schieben Sie vorsichtig einen Finger (in der Regel den Daumen) auf die dorsale Seite des Körpers/Halses hinter dem Kopf, um den Kopf in Position zu bringen.
- Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Schwanz zusammenkneifen, und fahren Sie nur dann mit der Elektroporation fort, wenn sich der Welpe in der entsprechenden Anästhesieebene befindet. Drücken Sie die Elektrodenpaddel am rostralen Teil des Mauskopfes leicht zusammen und legen Sie sie über die Augen. Drücken Sie einmal das Elektroden-Fußpedal, um die Elektroporation zu starten. Dieses Protokoll verwendet fünf Impulse von 120 V (50 ms, getrennt durch 950 ms); Jeder Impuls wird hörbar sein.
- Drehen Sie die Elektrodenpaddel bei jedem Impuls leicht gegen den Uhrzeigersinn, so dass sich das positive Paddel in Richtung der Oberseite des Kopfes bewegt.
HINWEIS: Bei richtiger Elektroporation wird man spüren/sehen, wie der Körper des Mäusewelpen bei jedem Impuls zuckt.
- Drehen Sie die Elektrodenpaddel bei jedem Impuls leicht gegen den Uhrzeigersinn, so dass sich das positive Paddel in Richtung der Oberseite des Kopfes bewegt.
- Nach dem letzten Impuls entfernen Sie die Paddel und legen sie zur Seite. Legen Sie den Welpen auf ein sauberes Papiertuch und lassen Sie ein anderes Labormitglied das Gel vom Kopf des Welpen reinigen und legen Sie es unter eine Wärmelampe auf ein Papierhandtuch-"Boot".
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Wärmelampe nicht zu nahe an den Welpen befindet. Stellen Sie sicher, dass ein anderes Labormitglied bei diesem Schritt hilft und behalten Sie die Welpen ständig im Auge. Oft hilft es, die Welpen in der Hand unter die Wärmelampe zu halten, um die Wärme für den Welpen zu erhöhen. Eine sanfte Massage des Bauches des Welpen kann ebenfalls bei der Genesung helfen. - Bringen Sie die Welpen in den häuslichen Käfig zurück, sobald ihr Körper eine gesunde rosa Farbe hat und auf ein leichtes Kneifen des Schwanzes quietscht.
HINWEIS: Bevor Sie sie wieder in den Käfig setzen, nehmen Sie eine kleine Menge des Einstreumaterials für den Heimkäfig und bürsten Sie die Welpen leicht damit, um den Käfigduft zu erhalten. Setzen Sie die Welpen wieder in den Käfig unter das Einstreumaterial und kehren Sie in den Haltungsraum zurück.
5. Postoperative Schritte
- Führen Sie die nicht verwendete Plasmidmischung von der Mikroinjektor-Glaspipette zurück in das Röhrchen. Wenn noch genügend Mischung übrig ist, kann diese in zukünftigen Verfahren verwendet werden. Bei -20 °C lagern.
- Wischen Sie das Gel mit Papiertüchern von den Elektrodenpaddeln ab.
- Bringen Sie alle Geräteteile wieder an ihren ursprünglichen Platz zurück.
HINWEIS: Wenn die Glaspipettenspitze nach der Aufnahme der Plasmidmischung mit einer Schere abgeschnitten wurde, lassen Sie die Schere heraus, um sie gründlich mit DNase-Lösung zu reinigen. - Sprühen Sie den Tisch mit einem chemischen Desinfektionsmittel ab, wischen Sie ihn dann ab, gefolgt von einem Sprühen mit 70 % Ethanol und wischen Sie ihn dann wieder ab.
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Representative Results
Das oben beschriebene Protokoll wurde verwendet, um sowohl pädiatrische als auch erwachsene Hirntumor-Mausmodelle erfolgreich zu entwickeln, wobei erstere ausführlich in Kim et al.8 veröffentlicht wurden. Mit der richtigen Technik und sorgfältiger Planung des Plasmiddesigns beträgt der Erfolg für die EP-Entwicklung von Tumoren in der Regel 100%. Die Histologie ist der schnellste und einfachste Weg, um die erfolgreiche Insertion von DNA-Plasmiden zu überprüfen, wenn ein Reporterprotein verwendet wird. Dieses Protokoll beinhaltet Schritte zur Entwicklung eines GBM-Hirntumormodells mit 100%iger Penetranz, wie durch histologische Analysen bestätigt. Ein MADR-Donorplasmid exprimierte sowohl ein Reporterprotein (smTagBFP2-V5) als auch SpCas9 (Supplementary File 1). Zwei starke LOF-Tumorsuppressor-Gen-Single-Guide-RNAs (sgRNAs) wurden ebenfalls eingeschlossen, die auf Nf1 und Trp53 gerichtet sind (siehe Referenz12 für die Strategie der sgRNA-Klonierung; siehe Ergänzungsdatei 1 für Oligonukleotidsequenzen, die in diesem Protokoll verwendet werden). Schließlich wurden die Cre- und Flp-Rekombinase-Plasmide zur Rekombination am Rosa26-Locus zur Plasmidmischung hinzugefügt (Abbildung 1A; siehe Zusatzdatei 1). Die Mäuse waren 5 Monate nach der EP moribund, wobei das vollständige Tumorwachstum durch das Reporterprotein und die histologische Analyse nachgewiesen wurde (Abbildung 1B).
Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung des erfolgreichen Tumorwachstums 5 Monate nach EP . (A) MADR-Donorplasmid für spCas9 und das Reporterprotein TagBFP2-V5. Ebenfalls in der Plasmidmischung enthalten war ein Cre-Flp-Rekombinase-Plasmid, zusammen mit sgRNAs, die auf Nf1 und Trp53 gerichtet sind. (B) Ein koronaler Schnitt, der 5 Monate nach EP eines GBM-Tumors entnommen wurde, der durch Nf1 und Trp53 LOF angetrieben wird. Die Tumorzellen werden mit dem TagBFP-V5-Reporterprotein markiert, das an spCas9 (B3) gebunden ist. Eine spärliche EGFP-Markierung wird ebenfalls nachgewiesen (B2) zusammen mit allen Zellen, die die mit tdTomato markierten Plasmide nicht exprimiert haben (B1). Maßstabsleiste = 1.000 μm. Abkürzungen: Ctx = Cortex; CC = Corpus callosum; LV = lateraler Ventrikel; Str = striatum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Plasmidsequenzen. Vollständige Sequenzen aller Plasmide und Oligonukleotide, die in diesem Protokoll verwendet werden, einschließlich pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre und der Oligonukleotide für sgRNA, die auf Trp53 und Nf1 abzielt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die elektroporationsbasierte Verabreichung von Plasmid-DNA ermöglicht die In-vivo-Anwendung der Molekularbiologie, ähnlich wie in gentechnisch veränderten Mausmodellen, jedoch mit der Geschwindigkeit, Lokalisierung und Effizienz der viralen Transduktion 8,13,14. Letzteres bringt jedoch Sicherheitsbedenken sowie Immunreaktionen mit sich. Wir haben in unserem Modellierungssystem unter Verwendung der EP-Verabreichung von Plasmid-DNA gezeigt, dass eine minimale Immunantwort aufgrund des anfänglichen Einführens der Glaskapillarpipette in den Hirnventrikel8 auftritt. Um die aktuellen Tumormodellierungssysteme für die Immuntherapie zu verbessern, ermöglicht das oben vorgestellte Protokoll daher ein zweckmäßigeres und robusteres präklinisches Modellierungssystem für Hirntumoren.
Der erste entscheidende Schritt für eine erfolgreiche Hirntumormodellierung mit dieser Methode ist das Plasmiddesign. Obwohl es in diesem Protokoll nicht beschrieben ist, wurde es in Kim et al.8 und Rincon Fernandez Pacheco et al.10 für pädiatrische Hirntumormodelle sowie in anderen Quellen für zusätzliche Anwendungen ausführlich diskutiert15,16. Während unser Labor erfolgreich bis zu sechs Plasmide elektroporiert hat, gibt es eine Obergrenze für die Menge an DNA, die abgegeben werden kann. Diese Obergrenze wird durch die Plasmid-DNA-Konzentration, die Plasmidgrößen, die Spannung und das Volumen der abgegebenen DNA begrenzt, das wiederum durch die Größe des Hirnventrikels im Alter der Elektroporation begrenzt ist. Darüber hinaus ist es bei mehreren DNA-Plasmiden in der Mischung unerlässlich, vor der Injektion eine gut suspendierte Plasmidmischung zu haben. Wenn die Mischung nicht gut resuspendiert wird, wird es schwierig sein, sie in die schmale Glaskapillarpipette aufzunehmen. Mit der richtigen Plasmidmischung ermöglicht die Zugabe von schnellem grünem Farbstoff (10 % v/v) eine klare Sicht auf die Plasmidmischung, die während der Verabreichung in der Hirnkammer aufgenommen wird (Schritt 3.4). Ein wichtiger Vorbehalt dabei ist jedoch, dass der Farbstoff die Antikörperfärbung in den dunkelroten Wellenlängen (z. B. Cy5) von Gewebe stören kann, das innerhalb weniger Wochen nach EP8 verarbeitet wurde. Obwohl der schnelle grüne Farbstoff beim ersten Erlernen von EP sehr hilfreich ist, kann er eliminiert werden, um falsch-positive Färbungen zu vermeiden. Es ist zu beachten, dass bei Schritt 3.4 die Abgabe der Plasmidmischung in den Ventrikel nicht sichtbar ist, so dass es wichtig ist, die Glaspipette zu beobachten, damit das Volumen während der Injektion abnimmt.
Für die Konsistenz und den richtigen Umgang mit Injektionen sind mehrere Faktoren zu beachten: 1) das Injektionsvolumen. Obwohl mehrere Versuche erforderlich sein können, um die Glaskapillarpipette genau zu schneiden (Schritt 2.1.2), ist es wichtig, dass für jedes Tier nur 1 μl Plasmidmischung injiziert wird. Zu- oder Abnahmen des Volumens zwischen den Tieren wirken sich sicherlich auf die Latenz der Tumorbildung aus. 2) Sobald das Injektionsvolumen eingestellt ist, dürfen die Parameter des Mikroinjektors nicht mehr geändert werden, da dies das Volumen beeinflusst. 3) Sobald die Plasmidmischung in die Glaskapillarpipette gebracht wurde, sollte die Pipette aus dem Weg geräumt werden, um sich oder andere nicht versehentlich anzustoßen. Hierfür ist die Verwendung eines Mikropipettenständers (Löthilfe; siehe Materialtabelle) sinnvoll, der auf den Mikroinjektorhalter geklipst wird. Wenn die Plasmidmischung jedoch nicht bald danach injiziert wird, wird sie wahrscheinlich die Spitze verstopfen. Daher ist es wichtig, unmittelbar vor der Injektion in die Hirnkammer eine Testmikroinjektion auf einem Stück Parafilm durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Öffnung nicht verstopft ist. Schließlich ist die Durchführung des Protokolls, ähnlich wie bei jeder anderen Operationstechnik, für jeden Einzelnen unterschiedlich. Es ist daher zwingend erforderlich, dass derselbe Techniker die Mikroinjektion und/oder EP für alle Gruppen von Mäusen in einem Experiment durchführt.
Die in unserem Labor entwickelten Hirntumormodelle haben sich auf Gliome konzentriert. Aus neurobiologischer Sicht zielt die Durchführung dieser Methode zwischen den postnatalen Tagen 0-3 auf die Gliogenese und die postembryonale Neurogenese ab. Das Interesse an alternativen Hirntumoren kann eine Anpassung des Zeitpunkts und/oder der Position der Elektroden erfordern. Für die in utero EP stehen mehrere Protokolle zur Verfügung, die für neuronale Tumoren relevant sind15,17,18.
Es gibt einige Einschränkungen bei dieser Methode. Die Möglichkeit, sowohl LOF- als auch GOF-DNA-Plasmide mit CRISPR, Transposons und neuerdings auch dem MADR-System zu klonen und zu mischen und anzupassen, ermöglicht die Modellierung endloser Kombinationen von Patientenmutationen. Die Techniken der Mikroinjektion und der EP sind relativ einfach, obwohl sie ein paar Übungsversuche erfordern, um sich zu verbessern und konsistent zu werden. Eine Einschränkung des vorgestellten Modells ist die Zeitspanne, die der GBM-Tumor benötigt, um sich vollständig zu entwickeln (5 Monate). Trotzdem arbeiten wir derzeit an weiteren Modellen mit häufigen Tumormutationen von Patienten, die zu einem aggressiven Tumorwachstum führen, das weniger als 2 Monate anhält. Zusätzlich zu den Einschränkungen ist die Ausrüstung selbst eine erhebliche Anfangsinvestition (etwa 20.000 bis 30.000 US-Dollar). Die Fähigkeit, Dutzende, wenn nicht Hunderte von Mäusen in einer Sitzung zu elektropolieren, ermöglicht jedoch eine unglaubliche Leistung für ein präklinisches Experiment. Wenn es jedoch Probleme mit der Mäusezucht gibt, kann dies zur größten Einschränkung werden, da es unerlässlich ist, gesunde Züchter und gesunde Würfe zu haben.
Es ist mehrere Jahrzehnte her, dass Fortschritte in der Behandlung von Hirntumoren erzielt wurden, wobei die letzte große Verbesserung des Chemotherapeutikums Temozolomid das Überleben nur um wenige Monate verlängerte19. Die Immuntherapie hat viele verschiedene Krebsarten revolutioniert, hat aber noch keinen signifikanten Einfluss auf die Standardbehandlung in der Neuroonkologie. Interessanterweise haben die derzeit verwendeten Hirntumormodelle der Maus große Erfolge bei der Immuntherapie gezeigt, scheitern aber immer wieder daran, sich auf die Klinik zu übertragen und Erfolge bei Patienten zu zeigen. Es ist daher zwingend erforderlich, einen Schritt zurückzutreten und die verwendeten Maustumormodelle neu zu bewerten. Derzeitige Modelle beruhen auf der Verwendung älterer Zelllinien mit begrenzten Mutationen, die bei Patienten nicht häufig zu finden sind, während Tausende von Zellen in das Gehirn injiziert werden. Mit der in diesem Protokoll besprochenen Technik werden verschiedene Tumormutationsprofile von Patienten in einem Mausmodell rekapituliert, was eine autochthone, allmähliche Entwicklung von Tumoren innerhalb eines Zeitrahmens ermöglicht, der präklinische Tests in immunkompetenten Mäusen ermöglichen würde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Gi Bum Kim für die Immunfluoreszenzfärbung und die Bilder. Wir danken auch Emily Hatanaka, Naomi Kobritz und Paul Linesch für hilfreiche Ratschläge zum Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
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