Summary
A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.
Abstract
Os modelos tumorais são fundamentais para o teste pré-clínico de tumores cerebrais em termos de exploração de novos tratamentos mais eficazes. Com interesse significativo em imunoterapia, é ainda mais crítico ter um modelo de camundongo consistente, clinicamente pertinente e imunocompetente para examinar as populações de células tumorais e imunes no cérebro e sua resposta ao tratamento. Enquanto a maioria dos modelos pré-clínicos utiliza o transplante ortotópico de linhagens de células tumorais estabelecidas, o sistema de modelagem apresentado aqui permite uma representação "personalizada" de mutações tumorais específicas do paciente em um desenvolvimento gradual, mas eficaz, a partir de construções de DNA inseridas em células precursoras neurais (NPCs) em divisão in vivo. As construções de DNA apresentam a análise em mosaico com o método de troca de mediado por dupla recombinase (MADR), permitindo mutagênese somática de cópia única de mutações condutoras. Usando filhotes de camundongos recém-nascidos entre o nascimento e 3 dias de idade, os NPCs são visados aproveitando essas células em divisão que revestem os ventrículos laterais. A microinjeção de plasmídeos de DNA (por exemplo, derivados de MADR, transposons, sgRNA direcionado por CRISPR) nos ventrículos é seguida por eletroporação usando pás que circundam a região rostral da cabeça. Após a estimulação elétrica, o DNA é levado para dentro das células em divisão, com potencial de integração ao genoma. O uso deste método tem sido demonstrado com sucesso no desenvolvimento de tumores cerebrais pediátricos e adultos, incluindo o tumor cerebral maligno mais comum, o glioblastoma. Este artigo discute e demonstra as diferentes etapas do desenvolvimento de um modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluindo o procedimento de anestesia de filhotes jovens de camundongos, para microinjeção da mistura de plasmídeos, seguida de eletroporação. Com este modelo autóctone e imunocompetente do rato, os pesquisadores terão a capacidade de expandir as abordagens da modelagem pré-clínica, nos esforços para melhorar e examinar o tratamento eficaz do cancro.
Introduction
Modelos de tumores cerebrais murinos são cruciais para a compreensão dos mecanismos de formação e tratamento de tumores cerebrais. Os modelos atuais tipicamente incluem transplantes subcutâneos ou ortotópicos de linhagens de células tumorais comumente usadas, baseados em um número limitado de mutações condutoras ou modelos de xenoenxertos derivados do paciente, usando camundongos imunodeficientes que dificultam estudos adequados de imunoterapia 1,2,3,4. Além disso, esses resultados pré-clínicos podem levar a falsos positivos, na medida em que tais modelos podem exibir efeitos dramáticos, muitas vezes curativos, em resposta à terapia, mas isso não se traduz na clínica2,5,6,7. Ter a capacidade de produzir rapidamente modelos pré-clínicos de camundongos geneticamente modificados que reflitam mais as assinaturas de mutação do paciente é imperativo para melhorar a validade dos resultados pré-clínicos.
A liberação de plasmídeos de DNA baseada em eletroporação (EP) para induzir mutações tanto na perda de função (LOF) quanto no ganho de função (GOF) permite a geração de tais modelos. Desenvolvemos um método para uma representação ainda mais precisa de mutações do driver GOF chamado análise em mosaico com troca de mediada por dupla recombinase, ou MADR8. Esse método permite a expressão de um gene (ou genes) de interesse de forma controlada e locus-específica em célulassomáticas8. Em combinação com outras ferramentas moleculares, como repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), diferentes mutações de pacientes podem ser combinadas para desenvolver modelos de tumor cerebral em camundongos. Esse método tem sido utilizado para diferentes tumores cerebrais pediátricos, incluindo gliomas e ependimomas8, bem como para modelos de tumores cerebrais adultos, como o glioblastoma (GBM).
Embora o método EP de modelagem tumoral não seja tão comum quanto um transplante, o seguinte demonstra até agora a facilidade e a alta reprodutibilidade desse sistema de modelagem. Camundongos mTmG são utilizados para a inserção do DNA do plasmídeo MADR 8,9. Esse sistema permite a recombinação dos sítios alvo de loxP e Flp recombinase (FRT) localizados no locus Rosa26 para posterior inserção do plasmídeo de DNA do doador (i.e., gene GOF de interesse)8,9. O protocolo a seguir demonstra a simplicidade deste método após a prática diligente e a capacidade de desenvolver modelos de tumor cerebral de camundongo de maneira autóctone e consistente.
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Protocol
Todos os procedimentos deste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cedars Sinai Medical Center (IACUC). Camundongos homozigotos mTmG foram criados com camundongos C57BL/6J para obter ninhadas de camundongos mTmG heterozigotos de sexo misto para uso no protocolo a seguir. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os filhotes de camundongos foram eletroporados entre os dias 0 e 3 pós-natais (P0-P3).
1. Arranjo cirúrgico
- Borrife a mesa cirúrgica com desinfetante químico (por exemplo, Vimoba) e limpe, seguido de etanol a 70%, e limpe novamente.
- Coloque os seguintes instrumentos/materiais na mesa cirúrgica: pipetas capilares de vidro puxadas (ver referência10 sobre como puxar pipetas), tesouras pequenas, recipiente de resíduos de materiais perfurocortantes de risco biológico, pontas de pipeta e pipeta de microlitros, 2x pedaços quadrados cortados de filme de parafina, gel de eletrodo, eletrodos, suporte para o microinjetor e mistura de plasmídios de DNA (ver Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1).
- Coloque os seguintes acessórios no equipamento na mesa cirúrgica ou no chão, quando indicado: painel de controle do microinjetor, suporte e plugue acoplados à máquina, suporte para segurar o suporte do microinjetor ao lado (auxiliar de solda), pedal do microinjetor (no chão), eletrodos acoplados à máquina e pedal do eletrodo (no chão) (ver Tabela de Materiais).
OBS: O pedal do eletrodo foi colocado à direita do pedal do microinjetor como lembrete da ordem de uso. - Ligue os painéis de controle do microinjetor e do eletrodo.
- Verifique se as configurações do microinjetor estão corretas para o experimento: a pressão deve estar entre 220-450 hPa, dependendo de como a mistura plasmidial é absorvida.
- Verifique se as configurações no painel de eletrodos estão corretas para o experimento.
NOTA: Para o experimento atual (e a maioria dos nossos modelos de tumor cerebral), cinco pulsos de 120 V (50 ms; separados por 950 ms) são usados.
2. Preparo pré-cirúrgico
- Preparar a mistura de plasmídeos no microinjetor.
- Recupere uma pipeta capilar de vidro puxada e insira-a no suporte do microinjetor. Certifique-se de que a ponta está rosqueada para manter no lugar.
- Segure o suporte do microinjetor em uma mão e a tesoura pequena com a outra; Tenha a ponta da pipeta sobre um pequeno recipiente de risco biológico para materiais perfurocortantes. Com a tesoura fechada, pressione levemente a pipeta capilar de vidro alongada. Corte onde se vê a curva, a aproximadamente 2 mm da abertura. Se o corte parecer bem-sucedido, coloque cuidadosamente ao lado.
- Coloque o tubo de mistura de plasmídeos disponível comercialmente sobre a mesa cirúrgica e abra. Tenha a caixa da ponta da pipeta ou outro item atrás do fundo do tubo para mantê-lo estável durante a extração da mistura de plasmídeos. Coloque a pipeta de vidro que está presa à linha do microinjetor plana sobre a mesa e insira suavemente no tubo da mistura de plasmídeos, certificando-se de que a ponta esteja bem na mistura perto do fundo do tubo.
NOTA: Devido à sucção por gravidade natural, a aspiração da mistura de plasmídeos começará na pipeta de vidro antes de entrar ativamente. - Com a ponta da pipeta de vidro na mistura de plasmídeos, use o painel do microinjetor para aumentar a quantidade que está sendo aspirada. A partir de 0, gire o botão direito e marque na direção negativa em direção a -60 - isso trará a mistura de plasmídeos para a pipeta de vidro. Traga apenas ~1 polegada de mistura de plasmídeos. Volte o botão para 0 e, em seguida, remova a ponta da pipeta da mistura.
NOTA: Não remova a ponta da pipeta da mistura enquanto estiver na direção negativa, pois isso disparará a mistura para o microinjetor e, possivelmente, para a tubulação. - Teste a quantidade de mistura em uma injeção injetando a mistura em uma tira de filme de parafina. Use o pedal e pressione uma vez para injetar a mistura na película de parafina. Use o pipetador regulado em 1 μL para pegar a mistura no filme de parafina para ver se é exatamente 1 μL.
NOTA: Se for ligeiramente inferior a 1 μL, a pressão do microinjector pode ser aumentada. Se a pressão estiver se aproximando de 450 hPa e ainda menor que 1 μL, a abertura da pipeta de vidro é muito pequena e precisará ser mais aparada. Sugere-se colocar a mistura de plasmídeos de volta no tubo antes de aparar. Apesar disso, ainda haverá uma mistura residual na tesoura, por isso é imperativo limpar completamente a tesoura depois com DNase para remover qualquer mistura restante. Se a injeção for superior a 1 μL, uma nova pipeta de vidro puxada precisará ser usada e aparada. Quando a quantidade de teste é exatamente 1 μL, a ponta da pipeta de vidro está no tamanho certo. - Repita o passo 2.1.4 para desenhar uma mistura plasmidial adicional para o procedimento, ou cerca de 2-3 polegadas na pipeta de vidro puxada. Certifique-se de que a mistura não vá muito longe no microinjetor, onde não se pode ver o final.
NOTA: Ao desenhar na mistura de plasmídeos, é fundamental evitar bolhas de ar. Se houver bolhas, é necessário refazer essa etapa, removendo a mistura de plasmídios da pipeta de vidro puxada e começando novamente. Bolhas de ar presentes serão prejudiciais para os seguintes passos ao injetar no ventrículo do filhote. - Com a mistura de plasmídios pronta na pipeta de vidro puxada, coloque a pipeta preparada ao lado no suporte de auxílio de solda e fora do caminho para não tocá-la acidentalmente.
- Preparar os animais para o experimento.
- Prepare um balde de gelo para anestesiar filhotes. Adicione água ao balde de gelo para derreter e ajude a resfriar o suporte anestesiante (por exemplo, tampa da caixa de pipeta).
- Coloque a parte superior da caixa sobre o gelo derretido para esfriar.
- Retire cuidadosamente o(s) filhote(s) da gaiola e coloque-os na parte superior da caixa resfriada, que permanece no gelo. Coloque outra parte superior frouxamente sobre a parte inferior para ajudar no processo de resfriamento.
- Após 2-3 min, verifique os filhotes. Separe os filhotes uns dos outros, permanecendo na posição prona.
NOTA: Os filhotes se contorcem, mas isso diminuirá à medida que a anestesia fria entrar. A parte superior da caixa pode ser deixada de lado para facilitar a visualização dos filhotes. - Para verificar se há anestesia adequada, aperte a cauda do filhote e procure uma reação. Se houver uma reação, repetir o passo 2.2.4. Se nenhum chiado ou pouco movimento for feito, o filhote está pronto para o procedimento.
NOTA: Os ratos não devem ser mantidos no gelo por longos períodos de tempo, pois isso afetará sua capacidade de recuperação após o procedimento. Apenas o número de filhotes que podem ser injetados e eletroporados ainda sob anestesia deve ser colocado no gelo de cada vez; números maiores podem ser feitos com experiência.
3. Microinjeção de mistura de DNA plasmidial no ventrículo cerebral
- Coloque um filhote sobre a mesa na posição ventral.
- Puxe levemente para trás na parte de trás da cabeça para visualizar as suturas cranianas através da pele. Encontre lambda no crânio. O ventrículo/local de injeção estará a meio caminho entre o lambda e o olho.
OBS: Lambda é onde as suturas sagital e lambdoide se cruzam. Ver referência11 para a identificação de lambda no crânio de camundongos. - Perfure a pele com a ponta da pipeta de vidro em um ângulo perpendicular (a pipeta é reta em direção ao teto). Observe um leve recuo côncavo ao pressionar o crânio e uma resistência inicial. Uma vez perfurada e a ponta da pipeta de vidro perfura o recuo côncavo, o nível de injeção apropriado é atingido.
- Segure a ponta da pipeta de vidro no lugar e pressione o pedal do microinjetor uma vez para injetar 1 μL da mistura de plasmídeos.
NOTA: Há duas maneiras de ver claramente que a injeção foi bem-sucedida. Primeiro, peça a outro membro do laboratório que observe a mistura de plasmídeos descer na pipeta de vidro à medida que é injetada. Além disso, se usar verde rápido ou outro corante na mistura de plasmídeos, o corante se espalhará visivelmente no ventrículo sob a pele uma vez injetado e é facilmente visível quando mantido até uma lâmpada cirúrgica.
4. Eletroporação
- Coloque um pedaço de filme de parafina (um quadrado) sobre a mesa e esprema o gel do eletrodo por cima do filme. Cubra as pás do eletrodo em gel de eletrodo escovando uma quantidade generosa em cada pá. Qualquer excesso de gel que esteja pingando pode ser passado em um papel toalha.
OBS: Após o primeiro EP, não deixe o gel de cada pá tocar no outro lado. Isso transferirá a carga e, ao aplicar na cabeça do filhote, um som escaldante pode ser ouvido. Isso também acontecerá se o gel na cabeça do filhote de um eletrodo entrar em contato com o gel de outro.
CUIDADO: Deve-se tomar cuidado para manter os dedos afastados das pás durante a eletroporação. - Segure o corpo do filhote em uma das mãos (normalmente a mão não dominante), mantendo os dedos bem atrás da cabeça.
OBS: Se for destro, é mais fácil segurar o filhote com a mão esquerda e os eletrodos com a direita. Se for canhoto, faça o contrário. - Aproximar os eletrodos da cabeça do filhote para garantir que estejam na posição adequada, com o eletrodo positivo na parte externa da cabeça onde o ventrículo está sendo direcionado (por exemplo, se atingir o ventrículo esquerdo, coloque o positivo no lado esquerdo do filhote e o negativo no lado direito do filhote). Ao posicionar os eletrodos, deslize suavemente um dedo (normalmente o polegar) no lado dorsal do corpo/pescoço posterior à cabeça para ajudar a elevar a cabeça para a posição.
- Verifique a profundidade da anestesia apertando a cauda e proceda com a eletroporação somente se o filhote estiver no plano apropriado de anestesia. Aperte levemente as pás do eletrodo na parte rostral da cabeça do rato, colocando-as sobre os olhos. Pressione o pedal do eletrodo uma vez para iniciar a eletroporação. Esse protocolo utiliza cinco pulsos de 120 V (50 ms, separados por 950 ms); cada pulso será audível.
- A cada pulso, gire levemente as pás do eletrodo no sentido anti-horário para que a pá positiva esteja se movendo em direção ao topo da cabeça.
NOTA: Com a eletroporação adequada, sentir-se-á/verá o corpo do filhote de rato contrair-se a cada pulso.
- A cada pulso, gire levemente as pás do eletrodo no sentido anti-horário para que a pá positiva esteja se movendo em direção ao topo da cabeça.
- Após o pulso final, retire as pás e coloque ao lado. Mova o filhote para uma toalha de papel limpa e peça a outro membro do laboratório que limpe o gel da cabeça do filhote e coloque sob uma lâmpada de calor em um "barco" de papel toalha.
NOTA: Certifique-se de que a lâmpada de calor não está muito perto dos filhotes. Certifique-se de ter outro membro do laboratório para ajudar com esta etapa e manter um olho constante sobre os filhotes. Muitas vezes ajuda a segurar os filhotes na mão sob a lâmpada de calor para aumentar o calor para o filhote. Massagear suavemente o abdômen do filhote também pode ajudar na recuperação. - Devolva os filhotes para a gaiola de casa assim que seus corpos tiverem uma cor rosada saudável e tiverem uma resposta de chiado a um leve beliscão de cauda.
NOTA: Antes de colocá-los de volta na gaiola, pegue uma pequena quantidade do material de cama da gaiola caseira e escove levemente os filhotes com ele para o cheiro da gaiola. Coloque os filhotes de volta na gaiola sob o material de cama e retorne para a sala de espera.
5. Etapas pós-cirúrgicas
- Devolva a mistura de plasmídios não utilizada da pipeta de vidro do microinjetor de volta para o tubo. Se sobrar mistura suficiente, esta poderá ser utilizada em procedimentos futuros. Conservar a -20 °C.
- Limpe o gel das pás do eletrodo com papel toalha.
- Devolva todas as peças do equipamento de volta ao seu lugar original.
NOTA: Se a tesoura foi usada para cortar a ponta da pipeta de vidro após a mistura de plasmídios ter sido retirada, deixe a tesoura para limpar completamente com solução de DNase. - Borrife a mesa com um desinfetante químico, depois limpe, seguido de um borrife de etanol a 70% e, em seguida, limpe novamente.
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Representative Results
O protocolo descrito acima tem sido usado para desenvolver com sucesso modelos de camundongos com tumores cerebrais pediátricos e adultos, sendo o primeiro publicado em extenso detalhe em Kim et al.8. Com técnica adequada e planejamento cuidadoso do desenho do plasmídeo, o sucesso para o desenvolvimento de EP de tumores é tipicamente de 100%. A histologia é a maneira mais rápida e fácil de verificar se há inserção bem-sucedida de plasmídios de DNA quando uma proteína repórter é usada. Este protocolo envolve etapas de como desenvolver um modelo de tumor cerebral GBM com 100% de penetrância, conforme confirmado por análise histológica. Um plasmídeo doador MADR expressou uma proteína repórter (smTagBFP2-V5) e SpCas9 (Arquivo Suplementar 1). Dois RNAs de guia único do gene supressor de tumor LOF forte condutor (sgRNAs) também foram incluídos, direcionados a Nf1 e Trp53 (ver referência12 para estratégia de clonagem de sgRNA; ver Arquivo Suplementar 1 para sequências de oligonucleotídeos usadas neste protocolo). Finalmente, os plasmídeos Cre e Flp recombinase foram adicionados à mistura de plasmídeos para recombinação no locus Rosa26 (Figura 1A; ver Arquivo Suplementar 1). Os camundongos estavam moribundos 5 meses pós-EP, com crescimento tumoral completo detectado através da proteína repórter e análise histológica (Figura 1B).
Figura 1: Coloração por imunofluorescência do crescimento tumoral bem sucedido aos 5 meses pós-EP . (A) Plasmídeo doador MADR para spCas9 e a proteína repórter TagBFP2-V5. Também foi incluído na mistura de plasmídeos um plasmídeo Cre-Flp recombinase, juntamente com sgRNAs direcionados a Nf1 e Trp53. (B) Corte coronal realizado 5 meses pós-EP de tumor de GBM conduzido por Nf1 e Trp53 LOF. As células tumorais são marcadas com a proteína repórter TagBFP-V5 ligada a spCas9 (B3). Também é detectada marcação esparsa de EGFP (B2) junto com todas as células que não expressaram os plasmídeos marcados com tdTomato (B1). Barra de escala = 1.000 μm. Abreviações: Ctx = córtex; CC = corpo caloso; VE = ventrículo lateral; Str = estriado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Sequências de plasmídeos. Sequências completas de todos os plasmídeos e oligonucleotídeos usados neste protocolo, incluindo pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre, e os oligonucleotídeos para sgRNA visando Trp53 e Nf1. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A liberação de DNA plasmidial baseada em eletroporação permite o uso in vivo de biologia molecular, semelhante àquela usada em modelos de camundongos geneticamente modificados, mas com a velocidade, localização e eficiência da transdução viral 8,13,14. Com este último, no entanto, vêm preocupações de segurança, bem como respostas imunológicas. Demonstramos em nosso sistema de modelagem usando EP-liberação de DNA plasmidial que a resposta imune mínima ocorre devido à inserção inicial da pipeta capilar de vidro no ventrículo cerebral8. Portanto, para melhorar os atuais sistemas de modelagem tumoral para imunoterapia, o protocolo apresentado acima permite um sistema de modelagem pré-clínica mais rápido e robusto para tumores cerebrais.
O primeiro passo crucial para o sucesso da modelagem de tumores cerebrais usando este método é o design de plasmídeos. Embora não descrito neste protocolo, tem sido extensivamente discutido em Kim et al.8 e Rincon Fernandez Pacheco et al.10 para modelos de tumores cerebrais pediátricos, bem como outras fontes para usosadicionais15,16. Embora nosso laboratório tenha eletroporado com sucesso até seis plasmídeos, haverá um limite superior para a quantidade de DNA que pode ser entregue. Esse limite superior é limitado pela concentração de DNA plasmidial, tamanho dos plasmídeos, voltagem e volume de DNA entregue, que é limitado pelo tamanho do ventrículo cerebral na idade da eletroporação. Além disso, com múltiplos plasmídeos de DNA na mistura, é imperativo ter uma mistura de plasmídeos bem suspensa antes da injeção. Se a mistura não for bem ressuspensa, será difícil de absorver na pipeta capilar de vidro estreita. Além disso, com a mistura adequada de plasmídeos, a adição de corante verde rápido (10% v/v) permite uma visualização clara da mistura de plasmídeos absorvida no ventrículo cerebral durante a administração (passo 3.4). Uma ressalva importante a isso, no entanto, é que o corante pode interferir na coloração de anticorpos nos comprimentos de onda vermelho-distante (por exemplo, Cy5) do tecido processado dentro de várias semanas após a EP8. Embora o corante verde rápido seja muito útil ao aprender EP pela primeira vez, ele pode ser eliminado para evitar coloração falso-positiva. Vale lembrar que, para a etapa 3.4, a entrega da mistura de plasmídeos no ventrículo não será visível, por isso será fundamental observar a pipeta de vidro para que o volume diminua à medida que é injetada.
Para consistência e manuseio adequado das injeções, há vários fatores a ter em mente: 1) o volume de injeção. Embora possam ser necessárias várias tentativas para cortar a pipeta capilar de vidro com precisão (passo 2.1.2), é crucial que apenas 1 μL de mistura de plasmídios seja injetado para cada animal. Aumentos ou diminuições no volume entre os animais certamente afetarão a latência da formação tumoral. 2) uma vez definido o volume de injeção, os parâmetros do microinjetor não devem ser alterados, pois isso afetará o volume. 3) Uma vez que a mistura de plasmídios é trazida na pipeta capilar de vidro, a pipeta deve ser mantida fora do caminho para não cutucar acidentalmente a si mesmo ou a outros. O uso de um suporte de micropipeta (auxiliar de solda; consulte Tabela de Materiais) que se prende ao suporte do microinjetor é útil para isso. No entanto, se a mistura de plasmídeos não for injetada logo depois, provavelmente entupirá a ponta. Portanto, é importante fazer uma microinjeção de teste em um pedaço de parafilme imediatamente antes de injetar no ventrículo cerebral para se certificar de que não há entupimento bloqueando o orifício. Finalmente, como todas as outras técnicas cirúrgicas, a execução do protocolo é diferente para cada indivíduo. Portanto, é imperativo que o mesmo técnico realize a microinjeção e/ou EP para todos os grupos de camundongos em um experimento.
Os modelos de tumores cerebrais desenvolvidos em nosso laboratório têm se concentrado em gliomas. Do ponto de vista neurobiológico, a realização deste método entre os dias 0-3 pós-natais visa o período de gliogênese e o período pós-neurogênese embrionária. O interesse em tumores cerebrais alternativos pode exigir ajuste no ponto de tempo e/ou posição dos eletrodos. Vários protocolos estão disponíveis para EP in utero que seriam pertinentes para tumores neurais15,17,18.
Existem algumas limitações para este método. A capacidade de clonar, misturar e combinar plasmídeos de DNA LOF e GOF usando CRISPR, transposons e, mais recentemente, o sistema MADR permite que infinitas combinações de mutações de pacientes sejam modeladas. As técnicas de microinjeção e EP são relativamente simples, embora exijam algumas tentativas práticas para melhorar e se tornar consistentes. Uma limitação do modelo apresentado é o tempo que o tumor de GBM leva para se desenvolver completamente (5 meses). Apesar disso, estamos atualmente trabalhando em modelos adicionais usando mutações tumorais comuns em pacientes que levam a um crescimento tumoral agressivo com duração inferior a 2 meses. Além das limitações, o equipamento em si é um investimento inicial substancial (cerca de US $ 20.000 - US $ 30.000); No entanto, a capacidade de eletroporar dezenas, se não centenas de camundongos de uma só vez, permite um poder incrível para um experimento pré-clínico. Dito isso, se houver problemas com a criação de camundongos, essa pode se tornar a maior limitação, pois é imprescindível ter criadores saudáveis e ninhadas saudáveis.
Já se passaram várias décadas desde que ocorreram avanços no tratamento dos tumores cerebrais, sendo que a última maior melhora do quimioterápico Temozolomida estendeu a sobrevida em apenas alguns meses19. A imunoterapia revolucionou muitos tipos diferentes de câncer, mas ainda não causou um impacto significativo no padrão de atendimento em neuro-oncologia. Curiosamente, os modelos de tumor cerebral de camundongo usados atualmente têm mostrado grande sucesso com a imunoterapia, mas continuamente falham em traduzir para a clínica e mostrar sucesso com os pacientes. Portanto, é imperativo dar um passo atrás e reavaliar os modelos de tumor de camundongo usados. Os modelos atuais dependem do uso de linhagens celulares mais antigas com mutações limitadas não comumente encontradas em pacientes enquanto injetam milhares de células no cérebro. Com a técnica discutida neste protocolo, diferentes perfis de mutações tumorais em pacientes em um modelo de camundongo são recapitulados, permitindo um desenvolvimento autóctone e gradual de tumores dentro de um período de tempo que permitiria testes pré-clínicos em camundongos imunocompetentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Gi Bum Kim pela coloração imunofluorescente e imagens. Também agradecemos a Emily Hatanaka, Naomi Kobritz e Paul Linesch pelos conselhos úteis sobre o protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
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