Summary
Использование иммунокомпетентной, аутохтонной модели опухоли, основанной на распространенных мутациях пациента, для доклинических испытаний имеет решающее значение для иммунотерапевтического тестирования. Этот протокол описывает метод создания мышиных моделей опухолей головного мозга с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, которая представляет распространенные мутации пациента, что обеспечивает точную, воспроизводимую и согласованную модель мыши.
Abstract
Модели опухолей имеют решающее значение для доклинических испытаний опухолей головного мозга с точки зрения изучения новых, более эффективных методов лечения. При значительном интересе к иммунотерапии еще более важно иметь последовательную, клинически значимую, иммунокомпетентную мышиную модель для изучения популяций опухолевых и иммунных клеток в головном мозге и их реакции на лечение. В то время как большинство доклинических моделей используют ортотопическую трансплантацию установленных линий опухолевых клеток, представленная здесь система моделирования позволяет «персонализировать» представление специфических для пациента опухолевых мутаций в постепенном, но эффективном развитии из конструкций ДНК, вставленных в делящиеся нейральные клетки-предшественники (NPC) in vivo. Мозаичный анализ ДНК-конструкций осуществляется с помощью метода двойного рекомбиназно-опосредованного кассетного обмена (MADR), что позволяет осуществлять однокопийный соматический мутагенез драйверных мутаций. Используя новорожденных детенышей мышей в возрасте от рождения до 3 дней, NPC становятся мишенью, используя эти делящиеся клетки, выстилающие боковые желудочки. Микроинъекция плазмид ДНК (например, полученных из MADR, транспозонов, CRISPR-направленной sgRNA) в желудочки сопровождается электропорацией с помощью лопастей, которые окружают ростральную область головы. При электрической стимуляции ДНК поглощается делящимися клетками с возможностью интеграции в геном. Применение этого метода успешно продемонстрировано при развитии опухолей головного мозга как у детей, так и у взрослых, в том числе наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга – глиобластомы. В данной статье обсуждаются и демонстрируются различные этапы разработки модели опухоли головного мозга с использованием этой методики, включая процедуру обезболивания молодых детенышей мышей до микроинъекции плазмидной смеси с последующей электропорацией. С помощью этой автохтонной, иммунокомпетентной мышиной модели исследователи получат возможность расширить подходы к доклиническому моделированию в усилиях по улучшению и изучению эффективного лечения рака.
Introduction
Модели опухолей головного мозга мышей имеют решающее значение для понимания механизмов образования и лечения опухолей головного мозга. Современные модели, как правило, включают в себя быструю подкожную или ортотопическую трансплантацию широко используемых линий опухолевых клеток, основанных на ограниченном числе драйверных мутаций или моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, с использованием мышей с иммунодефицитом, которые препятствуют надлежащим исследованиям иммунотерапии 1,2,3,4. Кроме того, эти доклинические результаты могут приводить к ложноположительным результатам, поскольку такие модели могут демонстрировать драматические, часто лечебные эффекты в ответ на терапию, но это не переносится на клинику 2,5,6,7. Возможность быстро создавать генетически модифицированные доклинические модели мышей, которые в большей степени отражают мутационные сигнатуры пациентов, является обязательным условием для повышения достоверности доклинических результатов.
Доставка плазмид ДНК на основе электропорации (ЭП) для индуцирования мутаций с потерей функции (LOF) и усилением функции (GOF) позволяет создавать такие модели. Мы разработали метод для еще более точного представления мутаций драйверов GOF, называемый мозаичным анализом с двойным рекомбиназно-опосредованным кассетным обменом, или MADR8. Этот метод позволяет осуществлять экспрессию интересующего гена (или генов) контролируемым, локус-специфичным образом в соматических клетках8. В сочетании с другими молекулярными инструментами, такими как кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR), различные мутации пациентов могут быть объединены для разработки моделей опухолей головного мозга мышей. Этот метод был использован для различных опухолей головного мозга у детей, включая глиомы и эпендимомы8, а также для моделей опухолей головного мозга у взрослых, таких как глиобластома (ГБМ).
Несмотря на то, что ВП-метод моделирования опухолей не так распространен, как трансплантация, нижеследующее демонстрирует простоту и высокую воспроизводимость этой системы моделирования. Мышей mTmG используют для вставки MADR-плазмидной ДНК 8,9. Эта система позволяет осуществлять рекомбинацию сайтов-мишеней loxP и Flp-рекомбиназы (FRT), расположенных в локусе Rosa26, для последующей вставки плазмиды донорской ДНК (т.е. интересующего гена GOF)8,9. Следующий протокол демонстрирует прямолинейность этого метода после усердной практики и способность разрабатывать модели опухолей головного мозга мышей в автохтонной, последовательной манере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, предусмотренные этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Cedars Sinai. Гомозиготных мышей mTmG скрещивали с мышами C57BL/6J для получения пометов разнополых гетерозиготных мышей mTmG для использования в следующем протоколе. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей подвергались электропорации между 0 и 3 днями построждения (P0-P3).
1. Хирургическая подготовка
- Распылите на операционный стол химическое дезинфицирующее средство (например, Vimoba) и протрите, затем 70% этанолом, и снова протрите.
- Положите на хирургический стол следующие инструменты/материалы: стеклянные капиллярные пипетки (см. ссылку10 о том, как вытаскивать пипетки), маленькие ножницы, небольшой контейнер для отходов биологически опасных острых предметов, микролитровый пипетка и наконечники для пипеток, 2 нарезанных квадратных кусочка парафиновой пленки, электродный гель, электроды, держатель для микроинъектора и смесь плазмид ДНК (см. Таблицу материалов и Дополнительный файл 1).
- При наличии показаний установите на оборудование на операционном столе или на полу следующие насадки: панель управления микроинжектором, держатель и заглушка, прикрепленные к аппарату, подставка для удержания держателя микроинжектора сбоку (вспомогательное средство для пайки), ножная педаль микроинжектора (на полу), электроды, прикрепленные к аппарату, и ножная педаль электрода (на полу) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ножная педаль электрода была размещена справа от ножной педали микроинжектора в качестве напоминания о порядке использования. - Включите панели управления микроинжектором и электродом.
- Проверьте правильность настроек на микроинжекторе для эксперимента: давление должно быть в пределах 220-450 гПа, в зависимости от того, как поглощается плазмидная смесь.
- Проверьте правильность настроек на панели электродов для эксперимента.
Примечание: В текущем эксперименте (и в большинстве наших моделей опухолей головного мозга) используются пять импульсов напряжением 120 В (50 мс; с интервалом 950 мс).
2. Предоперационная подготовка
- Приготовьте плазмидную смесь в микроинъекторе.
- Извлеките одну стеклянную капиллярную пипетку и вставьте ее в держатель микроинъектора. Убедитесь, что наконечник завинчен и удерживается на месте.
- Держите держатель микроинжектора в одной руке, а маленькие ножницы в другой; Держите кончик пипетки над небольшим контейнером для острых предметов, представляющих биологическую опасность. Закрыв ножницы, слегка надавите на удлиненную стеклянную капиллярную пипетку. Вырежьте в том месте, где виден изгиб, примерно в 2 мм от отверстия. Если срез выглядит удачным, аккуратно отложите в сторону.
- Положите имеющуюся в продаже пробирку для смешивания плазмид на хирургический стол и откройте. Поместите коробку с наконечником для пипетки или другой предмет за нижнюю часть тюбика, чтобы он оставался устойчивым во время забора плазмидной смеси. Положите стеклянную пипетку, прикрепленную к линии микроинъектора, на стол и осторожно вставьте в пробирку с плазмидной смесью, убедившись, что наконечник находится в смеси у дна пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за естественной гравитации всасывание смеси плазмид начнется в стеклянной пипетке до активного втягивания. - Когда кончик стеклянной пипетки находится в плазмидной смеси, используйте панель микроинжектора, чтобы увеличить количество втягиваемого препарата. Начиная с 0, поверните правую ручку и поверните регулятор в отрицательном направлении к -60 - это приведет смесь плазмид в стеклянную пипетку. Добавьте только ~1 дюйм смеси плазмид. Поверните ручку обратно в положение 0, а затем извлеките наконечник пипетки из смеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вынимайте наконечник пипетки из смеси в отрицательном направлении, так как это приведет к выбросу смеси в микроинжектор и, возможно, в трубку. - Проверьте количество смеси за одну инъекцию, впрыснув смесь на одну полоску парафиновой пленки. Используйте ножную педаль и нажмите один раз, чтобы впрыснуть смесь на парафиновую пленку. С помощью пипетки, установленной на 1 мкл, наберите смесь на парафиновую пленку, чтобы проверить, ровно ли она составляет 1 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если он немного меньше 1 мкл, давление микроинъектора можно увеличить. Если давление приближается к 450 гПа и по-прежнему меньше 1 мкл, отверстие стеклянной пипетки слишком маленькое и его необходимо обрезать больше. Перед обрезкой рекомендуется поместить плазмидную смесь обратно в пробирку. Несмотря на это, на ножницах все равно останется остаточная смесь, поэтому крайне важно тщательно очистить ножницы после этого с помощью ДНКазы, чтобы удалить оставшуюся смесь. Если объем инъекции превышает 1 мкл, необходимо использовать новую стеклянную пипетку и обрезать. Когда исследуемый объем составляет ровно 1 мкл, стеклянный наконечник пипетки имеет правильный размер. - Повторите шаг 2.1.4, чтобы набрать дополнительную смесь плазмид для процедуры или примерно на 2-3 дюйма в вытянутую стеклянную пипетку. Следите за тем, чтобы смесь не проникала слишком далеко в микроинжектор, где не видно конца.
ПРИМЕЧАНИЕ: При втягивании плазмидной смеси очень важно избегать пузырьков воздуха. Если пузырьки присутствуют, необходимо повторить этот шаг, удалив плазмидную смесь из вытянутой стеклянной пипетки и начав заново. Присутствующие пузырьки воздуха будут вредны для следующих этапов при инъекции в желудочек щенка. - Когда плазмидная смесь готова в вытянутой стеклянной пипетке, отложите подготовленную пипетку в сторону на подставку для пайки и не мешайте, чтобы случайно не задеть ее.
- Подготовьте животных к эксперименту.
- Подготовьте ведерко со льдом для обезболивания щенков. Добавьте воду в ведерко со льдом, чтобы она растаяла, и помогите охладить держатель для анестезии (например, крышку коробки для пипетки).
- Положите крышку коробки на растаявший лед, чтобы он остыл.
- Осторожно выньте щенков из клетки и поместите их в остывшую крышку коробки, которая останется на льду. Наденьте еще одну верхнюю часть поверх нижней, чтобы помочь процессу охлаждения.
- Через 2-3 мин проверьте щенков. Отделите щенков друг от друга, оставаясь в положении лежа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки будут извиваться, но это замедлится, когда начнется холодная анестезия. Верхнюю часть коробки можно опустить для удобства просмотра щенков. - Чтобы проверить правильность анестезии, ущипните щенка за хвост и посмотрите на реакцию. Если есть реакция, повторите шаг 2.2.4. Если щенок не визжит или мало двигается, он готов к процедуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей не следует держать на льду в течение длительных периодов времени, так как это повлияет на их способность восстанавливаться после процедуры. Только то количество щенков, которым можно как вводить, так и электропорировать, пока они еще находятся под наркозом, должно быть положено на лед за один раз; Большее количество можно сделать с опытом.
3. Микроинъекция смеси плазмид ДНК в желудочек головного мозга
- Положите щенка на стол в брюшном положении.
- Слегка оттяните назад затылок, чтобы визуализировать швы черепа через кожу. Найдите лямбду на черепе. Место введения желудочка/инъекции будет находиться на полпути между лямбдой и глазом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лямбда - это место пересечения сагиттального и лямбдовидного швов. Идентификация лямбды на черепе мыши приведена в ссылке11 . - Проткните кожу стеклянным наконечником пипетки под перпендикулярным углом (пипетка направлена прямо вверх к потолку). Обратите внимание на небольшое вогнутое углубление при надавливании на череп и начальное сопротивление. После прокалывания и протыкания стеклянного наконечника пипетки через вогнутое углубление достигается соответствующий уровень инъекции.
- Удерживая стеклянный наконечник пипетки на месте, нажмите на ножную педаль микроинъектора один раз, чтобы ввести 1 мкл плазмидной смеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два способа убедиться в том, что инъекция прошла успешно. Во-первых, попросите другого сотрудника лаборатории наблюдать, как смесь плазмид опускается в стеклянную пипетку во время введения. Кроме того, при использовании быстрого зеленого или другого красителя в плазмидной смеси краситель будет заметно распространяться в желудочке под кожей после инъекции и будет легко виден, если поднести его к хирургической лампе.
4. Электропорация
- Положите на стол кусок парафиновой пленки (один квадрат) и выдавите электродный гель поверх пленки. Покройте электродные лопасти гелем для электродов, обильно нанеся его на каждую лопасть. Излишки геля, которые капают, можно смахнуть бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: После первого EP не позволяйте гелю с каждой лопасти касаться другой стороны. Это передаст заряд, и при прикладывании к голове щенка может быть слышен шипящий звук. Это произойдет и в том случае, если гель на голове щенка с одного электрода соприкоснется с гелем с другого.
ВНИМАНИЕ: Во время электропорации необходимо следить за тем, чтобы пальцы не касались лопастей. - Держите тело щенка одной рукой (как правило, недоминантной рукой), держа пальцы за головой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы правша, проще всего держать щенка левой рукой, а электроды — правой. Если левша, сделайте наоборот. - Поднесите электроды близко к голове щенка, чтобы убедиться, что они находятся в правильном положении, при этом положительный электрод находится на внешней стороне головы, на которую нацелен желудочек (например, если вы нацелены на левый желудочек, поместите положительный на левую сторону щенка, а отрицательный — на правую сторону щенка). При размещении электродов осторожно проведите пальцем (обычно большим пальцем) по тыльной стороне тела/шеи позади головы, чтобы помочь поднять голову в нужное положение.
- Проверьте глубину анестезии, зажав хвост, и приступайте к электропорации только в том случае, если щенок находится в соответствующей плоскости анестезии. Слегка сожмите лопасти электродов на ростральной части головки мыши, расположив их над глазами. Нажмите ножную педаль электрода один раз, чтобы начать электропорацию. В этом протоколе используются пять импульсов по 120 В (50 мс, разделенные 950 мс); Будет слышен каждый импульс.
- С каждым импульсом слегка поворачивайте лопасти электрода против часовой стрелки, чтобы положительная лопастик двигалась к верхней части головки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При правильной электропорации вы почувствуете/увидите, как тело детеныша мыши дергается с каждым импульсом.
- С каждым импульсом слегка поворачивайте лопасти электрода против часовой стрелки, чтобы положительная лопастик двигалась к верхней части головки.
- После последнего импульса снимите лопатки и отложите в сторону. Переместите щенка на чистое бумажное полотенце и попросите другого сотрудника лаборатории смыть гель с головы щенка и поместить под тепловую лампу на бумажное полотенце «лодочка».
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тепловая лампа не находится слишком близко к щенкам. Позаботьтесь о том, чтобы другой сотрудник лаборатории помог вам на этом этапе, и постоянно следите за щенками. Часто полезно держать щенков в руке под тепловой лампой, чтобы увеличить тепло для щенка. Легкий массаж живота щенка также может помочь в выздоровлении. - Верните щенков в домашнюю клетку, как только их тела приобретут здоровый розоватый цвет и начнут писковать на легкое пощипывание хвоста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем, как поместить их обратно в клетку, возьмите небольшое количество подстилочного материала домашней клетки и слегка почистите им щенков для запаха клетки. Поместите щенков обратно в клетку под подстилку и вернитесь в помещение для хранения.
5. Послеоперационные этапы
- Верните неиспользованную смесь плазмид из стеклянной пипетки микроинжектора обратно в пробирку. Если смеси осталось достаточно, ее можно использовать в будущих процедурах. Хранить при температуре -20 °C.
- Сотрите гель с электродных лопастей бумажными полотенцами.
- Верните все детали оборудования на прежнее место.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если для разрезания стеклянного наконечника пипетки использовались ножницы после того, как плазмидная смесь была взята, оставьте ножницы для тщательной очистки раствором ДНКазы. - Распылите на стол химическое дезинфицирующее средство, затем протрите, затем распылите 70% этанола, затем снова протрите.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный выше, был использован для успешной разработки как детских, так и взрослых моделей мышей с опухолями головного мозга, причем первая из них была подробно опубликована в Kim et al.8. При правильной технике и тщательном планировании плазмидного дизайна успех развития ВП опухолей обычно составляет 100%. Гистология является самым быстрым и простым способом проверки успешной вставки плазмиды ДНК при использовании репортерного белка. Этот протокол включает в себя шаги по разработке модели опухоли головного мозга GBM со 100% пенетрантностью, что подтверждено гистологическим анализом. Донорская плазмида MADR экспрессировала как репортерный белок (smTagBFP2-V5), так и SpCas9 (дополнительный файл 1). Кроме того, были включены две сильные драйверные однонаправляющие РНК (sgRNA) гена-супрессора опухолей LOF, направленные на Nf1 и Trp53 (см. ссылку12 для стратегии клонирования sgRNA; см. Дополнительный файл 1 для олигонуклеотидных последовательностей, используемых в этом протоколе). Наконец, рекомбиназные плазмиды Cre и Flp были добавлены в плазмидную смесь для рекомбинации в локусе Rosa26 (рис. 1A; см. Дополнительный файл 1). Мыши умирали через 5 месяцев после ВП, при этом полный рост опухоли был обнаружен с помощью репортерного белка и гистологического анализа (рис. 1B).
Рисунок 1: Иммунофлуоресцентное окрашивание успешного роста опухоли через 5 месяцев после ВП . (A) Плазмида донора MADR для spCas9 и репортерного белка TagBFP2-V5. Также в плазмидную смесь была включена плазмида Cre-Flp-рекомбиназы, а также sgРНК, направленные на Nf1 и Trp53. (B) Корональный срез, взятый через 5 месяцев после EP опухоли GBM, индуцированной Nf1 и Trp53 LOF. Опухолевые клетки мечутся репортерным белком TagBFP-V5, связанным с spCas9 (B3). Также обнаруживается разреженное мечение EGFP (B2) вместе со всеми клетками, которые не экспрессировали плазмиды, меченные tdTomato (B1). Масштабная линейка = 1 000 мкм. Сокращения: Ctx = кора; CC = мозолистое тело; ЛЖ = боковой желудочек; Str = полосатое тело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Плазмидные последовательности. Полные последовательности всех плазмид и олигонуклеотидов, используемых в этом протоколе, включая pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre и олигонуклеотиды для sgRNA, нацеленные на Trp53 и Nf1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доставка плазмидной ДНК с помощью электропорации позволяет in vivo использовать молекулярную биологию, аналогичную той, которая используется в генетически модифицированных моделях мышей, но со скоростью, локализацией и эффективностью вирусной трансдукции 8,13,14. Последнее, однако, связано с проблемами безопасности, а также с иммунными реакциями. В нашей моделирующей системе с использованием ВП-доставки плазмидной ДНК мы показали, что минимальный иммунный ответ возникает за счет первичного введения стеклянной капиллярной пипетки в желудочек мозга8. Таким образом, для улучшения существующих систем моделирования опухолей для иммунотерапии, протокол, представленный выше, позволяет создать более целесообразную и надежную систему доклинического моделирования опухолей головного мозга.
Первым важным шагом для успешного моделирования опухолей головного мозга с помощью этого метода является плазмидный дизайн. Несмотря на то, что он не описан в этом протоколе, он широко обсуждался в Kim et al.8 и Rincon Fernandez Pacheco et al.10 для педиатрических моделей опухолей головного мозга, а также в других источниках для дополнительного использования15,16. Несмотря на то, что наша лаборатория успешно электропорировала до шести плазмид, существует верхний предел того, сколько ДНК может быть доставлено. Этот верхний предел ограничен концентрацией плазмидной ДНК, размерами плазмид, напряжением и объемом доставляемой ДНК, который, в свою очередь, ограничен размером желудочка головного мозга в возрасте электропорации. Кроме того, при наличии нескольких плазмид ДНК крайне важно иметь хорошо взвешенную смесь плазмид перед инъекцией. Если смесь плохо ресуспендировать, ее будет трудно взять в узкую стеклянную капиллярную пипетку. Кроме того, при правильном смешивании плазмид добавление быстрого зеленого красителя (10% v/v) позволяет четко видеть плазмидную смесь, поглощенную желудочком мозга во время введения (шаг 3.4). Однако одним из важных предостережений является то, что краситель может препятствовать окрашиванию антител в дальних красных волнах (например, Cy5) ткани, обработанной в течение нескольких недель после EP8. Несмотря на то, что быстрый зеленый краситель очень полезен при первом изучении ВП, его можно исключить, чтобы избежать ложноположительного окрашивания. Стоит иметь в виду, что на этапе 3.4 доставка плазмидной смеси в желудочек не будет видна, поэтому очень важно следить за стеклянной пипеткой, чтобы уменьшить объем по мере введения.
Для последовательности и правильного обращения с инъекциями необходимо учитывать несколько факторов: 1) объем инъекции. Несмотря на то, что для точной резки стеклянной капиллярной пипетки может потребоваться несколько попыток (шаг 2.1.2), крайне важно, чтобы каждому животному вводилось только 1 мкл плазмидной смеси. Увеличение или уменьшение объема между животными, безусловно, повлияет на латентность образования опухоли. 2) После того, как объем впрыска установлен, параметры микроинжектора нельзя изменять, так как это повлияет на объем. 3) После того, как плазмидная смесь попала в стеклянную капиллярную пипетку, пипетку следует держать в стороне, чтобы случайно не уколоть себя или других. Для этого полезно использовать подставку для микропипетки (приспособление для пайки; см. таблицу материалов), которая крепится к держателю микроинжектора. Однако, если плазмидная смесь не будет введена вскоре после этого, она, скорее всего, забьет наконечник. Поэтому важно сделать одну пробную микроинъекцию на кусочке парапленки непосредственно перед введением в желудочек головного мозга, чтобы убедиться в отсутствии закупорки, блокирующей отверстие. Наконец, как и в случае с любой другой хирургической техникой, выполнение протокола отличается для каждого человека. Поэтому крайне важно, чтобы один и тот же техник выполнял микроинъекцию и/или ВП для всех групп мышей в эксперименте.
Модели опухолей головного мозга, разработанные в нашей лаборатории, были сосредоточены на глиомах. С нейробиологической точки зрения, выполнение этого метода между постнатальными днями 0-3 нацелено на период глиогенеза и период постэмбрионального нейрогенеза. Интерес к альтернативным опухолям головного мозга может потребовать корректировки времени и/или положения электродов. Для внутриутробной ВП существует несколько протоколов, которые будут уместны для нейронных опухолей15,17,18.
У этого метода есть несколько ограничений. Возможность клонирования, смешивания и сопоставления плазмид ДНК LOF и GOF с использованием CRISPR, транспозонов и, в последнее время, системы MADR позволяет моделировать бесконечные комбинации мутаций пациентов. Техники микроинъекций и ВП относительно просты, хотя они требуют нескольких практических попыток, чтобы усовершенствоваться и стать последовательными. Одним из ограничений представленной модели является продолжительность времени, необходимого для полного развития опухоли GBM (5 месяцев). Несмотря на это, в настоящее время мы работаем над дополнительными моделями, использующими распространенные у пациентов опухолевые мутации, которые приводят к агрессивному росту опухоли продолжительностью менее 2 месяцев. В дополнение к ограничениям, само оборудование является существенным первоначальным вложением (около 20 000-30 000 долларов США); Тем не менее, способность электропорировать десятки, если не сотни мышей за один присест позволяет получить невероятную мощность для доклинического эксперимента. С учетом сказанного, если есть проблемы с разведением мышей, это может стать самым большим ограничением, так как крайне важно иметь здоровых заводчиков и здоровые пометы.
Прошло несколько десятилетий с тех пор, как были достигнуты успехи в лечении опухолей головного мозга, при этом последнее самое значительное улучшение химиотерапевтического темозоломида продлило выживаемость всего нанесколько месяцев. Иммунотерапия произвела революцию во многих видах рака, но ей еще предстоит оказать существенное влияние на стандарты лечения в нейроонкологии. Интересно, что используемые в настоящее время модели опухолей головного мозга мышей показали большой успех в иммунотерапии, но постоянно не могут быть применены в клинике и показать успех у пациентов. Поэтому крайне важно сделать шаг назад и пересмотреть используемые модели опухолей мышей. Современные модели основаны на использовании старых клеточных линий с ограниченными мутациями, которые обычно не встречаются у пациентов, при введении тысяч клеток в мозг. С помощью метода, описанного в этом протоколе, различные профили мутаций опухоли пациента в мышиной модели повторяются, что позволяет проводить автохтонное, постепенное развитие опухолей в течение периода времени, что позволило бы провести доклинические испытания на иммунокомпетентных мышах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим Ги Бум Кима за иммунофлуоресцентное окрашивание и изображения. Мы также благодарим Эмили Хатанаку, Наоми Кобриц и Пола Линеша за полезные советы по протоколу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
