Summary
Brug af en immunokompetent, autokton tumormodel drevet af almindelige patientmutationer til præklinisk test er kritisk for immunterapeutisk testning. Denne protokol beskriver en metode til at generere hjernetumormusemodeller ved hjælp af elektroporationsbaseret levering af plasmid-DNA, der repræsenterer almindelige patientmutationer, hvilket giver en nøjagtig, reproducerbar og konsistent musemodel.
Abstract
Tumormodeller er afgørende for den prækliniske test af hjernetumorer med hensyn til at udforske nye, mere effektive behandlinger. Med betydelig interesse for immunterapi er det endnu mere kritisk at have en konsistent, klinisk relevant, immunkompetent musemodel til at undersøge tumor- og immuncellepopulationerne i hjernen og deres respons på behandlingen. Mens de fleste prækliniske modeller anvender ortopisk transplantation af etablerede tumorcellelinjer, giver modelleringssystemet, der præsenteres her, mulighed for en "personlig" repræsentation af patientspecifikke tumormutationer i en gradvis, men effektiv udvikling fra DNA-konstruktioner indsat i delende neurale forløberceller (NPC'er) in vivo. DNA-konstruktioner indeholder mosaikanalysen med metoden med dobbelt-rekombinase-medieret kassetteudveksling (MADR), der muliggør enkeltkopi, somatisk mutagenese af drivermutationer. Ved hjælp af nyfødte museunger mellem fødslen og 3 dage gamle målrettes NPC'er ved at drage fordel af disse delende celler, der forer de laterale ventrikler. Mikroinjektion af DNA-plasmider (fx MADR-afledte, transposoner, CRISPR-rettet sgRNA) i ventriklerne efterfølges af elektroporation ved hjælp af padle, der omgiver hovedets rostrale region. Ved elektrisk stimulering optages DNA'et i de delende celler med potentiale til integration i genomet. Anvendelsen af denne metode er med succes blevet demonstreret ved udvikling af både pædiatriske og voksne hjernetumorer, herunder den mest almindelige maligne hjernetumor, glioblastom. Denne artikel diskuterer og demonstrerer de forskellige trin i udviklingen af en hjernetumormodel ved hjælp af denne teknik, herunder proceduren for bedøvelse af unge museunger, til mikroinjektion af plasmidblandingen efterfulgt af elektroporation. Med denne autoktone, immunkompetente musemodel vil forskere have mulighed for at udvide prækliniske modelleringsmetoder i bestræbelserne på at forbedre og undersøge effektiv kræftbehandling.
Introduction
Murine hjernetumor modeller er afgørende for at forstå mekanismerne for hjernetumor dannelse og behandling. Nuværende modeller omfatter typisk hurtigt producerede subkutane eller ortotopiske transplantationer af almindeligt anvendte tumorcellelinjer baseret på et begrænset antal drivermutationer eller patientafledte xenograftmodeller ved hjælp af immundefekte mus, der forhindrer korrekte immunterapistudier 1,2,3,4. Derudover kan disse prækliniske resultater føre til falske positive, idet sådanne modeller kan udvise dramatiske, ofte helbredende virkninger som reaktion på terapi, men dette oversætter ikke til klinikken 2,5,6,7. At have evnen til hurtigt at producere genetisk manipulerede prækliniske musemodeller, der i højere grad afspejler patientens mutationssignaturer, er afgørende for at forbedre validiteten af prækliniske resultater.
Elektroporation (EP)-baseret levering af DNA-plasmider for at inducere både tab af funktion (LOF) og forstærkning af funktion (GOF) mutationer muliggør generering af sådanne modeller. Vi udviklede en metode til en endnu mere præcis repræsentation af GOF drivermutationer kaldet mosaikanalyse med dual-recombinase-medieret kassetteudveksling eller MADR8. Denne metode giver mulighed for ekspression af et gen (eller gener) af interesse på en kontrolleret, locus-specifik måde i somatiske celler8. I kombination med andre molekylære værktøjer, såsom grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR), kan forskellige patientmutationer kombineres for at udvikle musehjernetumormodeller. Denne metode er blevet anvendt til forskellige pædiatriske hjernetumorer, herunder gliomer og ependymomas8, samt voksne hjernetumormodeller, såsom glioblastom (GBM).
Mens EP-metoden til tumormodellering ikke er så almindelig som en transplantation, viser følgende hidtil letheden og den høje reproducerbarhed af dette modelleringssystem. mTmG-mus anvendes til indsættelse af MADR-plasmid-DNA 8,9. Dette system giver mulighed for rekombination af loxP- og Flp-rekombinasemålsteder (FRT) placeret på Rosa26-locus til efterfølgende indsættelse af donor-DNA-plasmidet (dvs. GOF-gen af interesse)8,9. Følgende protokol demonstrerer ligefremheden af denne metode efter flittig praksis og evnen til at udvikle musehjernetumormodeller på en autokton, konsekvent måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i denne protokol blev godkendt af Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Homozygote mTmG-mus blev opdrættet med C57BL/6J-mus for at opnå kuld af heterozygote mTmG-mus af blandet køn til brug i følgende protokol. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Museunger blev elektroporeret mellem postnatal dag 0 og 3 (P0-P3).
1. Kirurgisk opsætning
- Sprøjt operationsbordet ned med kemisk desinfektionsmiddel (f.eks. Vimoba) og tør af, efterfulgt af 70% ethanol, og tør af igen.
- Anbring følgende instrumenter/materialer på operationsbordet: kapillærpipetter af trukket glas (se reference10 om, hvordan pipetter trækkes), små saks, små affaldsbeholdere til skarpe genstande ved biologisk fare, mikroliter pipettor og pipettespidser, 2x skårne firkantede stykker paraffinfilm, elektrodegel, elektroder, holder til mikroinjektoren og DNA-plasmidblanding (se materialetabel og supplerende fil 1).
- Placer følgende tilbehør på udstyret på operationsbordet eller på gulvet, når det er angivet: mikroinjektorkontrolpanel, holder og stik, der er fastgjort til maskinen, stativ til at holde mikroinjektorholderen til siden (loddehjælp), mikroinjektorfodpedal (på gulvet), elektroder fastgjort til maskinen og elektrodefodpedal (på gulvet) (se materialetabel).
BEMÆRK: Elektrodefodpedalen blev placeret til højre for mikroinjektorfodpedalen som en påmindelse om brugsrækkefølgen. - Tænd mikroinjektoren og elektrodekontrolpanelerne.
- Kontroller, at indstillingerne på mikroinjektoren er korrekte til eksperimentet: trykket skal være mellem 220-450 hPa, afhængigt af hvordan plasmidblandingen optages.
- Kontroller, at indstillingerne på elektrodepanelet er korrekte for eksperimentet.
BEMÆRK: Til det aktuelle eksperiment (og de fleste af vores hjernetumormodeller) anvendes fem impulser på 120 V (50 ms; adskilt af 950 ms).
2. Prækirurgisk forberedelse
- Forbered plasmidblandingen i mikroinjektoren.
- Tag en kapillarpipette af trukket glas, og sæt den i mikroinjektorholderen. Sørg for, at spidsen er skruet på for at holde den på plads.
- Hold mikroinjektorholderen i den ene hånd og den lille saks med den anden; Hav spidsen af pipetten over en lille beholder med biologisk fare for skarpe genstande. Når saksen er lukket, trykkes let ned på den forlængede glaskapillærpipette. Skær, hvor bøjningen ses, ca. 2 mm fra åbningen. Hvis snittet ser vellykket ud, skal du placere forsigtigt til siden.
- Placer det kommercielt tilgængelige plasmidblandingsrør fladt på operationsbordet og åbent. Hav pipettespidsboksen eller en anden genstand bag bunden af røret for at holde den stabil, mens du trækker plasmidblandingen op. Placer glaspipetten, der er fastgjort til mikroinjektorledningen, fladt på bordet, og indsæt forsigtigt i røret til plasmidblandingen, og sørg for, at spidsen er godt i blandingen nær bunden af røret.
BEMÆRK: På grund af naturlig tyngdekraftssugning begynder plasmidblandingssuget i glaspipetten, før den aktivt trækkes ind. - Med spidsen af glaspipetten i plasmidblandingen skal du bruge mikroinjektorpanelet til at øge mængden, der trækkes ind. Start ved 0, drej højre knap og drej i negativ retning mod -60 - dette vil bringe plasmidblandingen ind i glaspipetten. Medbring kun ~ 1 tommer plasmidblanding. Drej knappen tilbage til 0, og fjern derefter pipettespidsen fra blandingen.
BEMÆRK: Fjern ikke pipettespidsen fra blandingen, mens den er i negativ retning, da dette vil skyde blandingen ind i mikroinjektoren og muligvis ind i slangen. - Test mængden af blanding i en injektion ved at injicere blandingen på en strimmel paraffinfilm. Brug fodpedalen og tryk én gang for at injicere blandingen på paraffinfilmen. Brug pipettor indstillet til 1 μL til at optage blandingen på paraffinfilmen for at se, om den er nøjagtigt 1 μL.
BEMÆRK: Hvis det er lidt mindre end 1 μL, kan mikroinjektorens tryk øges. Hvis trykket nærmer sig 450 hPa og stadig mindre end 1 μL, er glaspipetteåbningen for lille og skal trimmes mere. Det foreslås at placere plasmidblandingen tilbage i røret inden trimning. På trods af dette vil der stadig være en restblanding på saksen, så det er bydende nødvendigt at rengøre saksen grundigt bagefter med DNase for at fjerne eventuel resterende blanding. Hvis injektionen er mere end 1 μL, skal en ny trukket glaspipette bruges og trimmes. Når testmængden er nøjagtigt 1 μL, har glaspipettespidsen den rigtige størrelse. - Gentag trin 2.1.4 for at trække yderligere plasmidblanding til proceduren eller ca. 2-3 tommer ind i den trukne glaspipette. Sørg for, at blandingen ikke går for langt ind i mikroinjektoren, hvor man ikke kan se enden.
BEMÆRK: Når du trækker plasmidblandingen ind, er det vigtigt at undgå luftbobler. Hvis der er bobler, er det nødvendigt at gentage dette trin ved at fjerne plasmidblandingen fra den trukne glaspipette og starte igen. Tilstedeværende luftbobler vil være skadelige for følgende trin, når de injiceres i hvalpens ventrikel. - Når plasmidblandingen er klar i den trukne glaspipette, anbringes den klargjorte pipette til siden på loddestøttestativet og af vejen for ikke ved et uheld at røre ved/støde den.
- Forbered dyrene til forsøget.
- Forbered en isspand til bedøvelse af hvalpe. Tilsæt vand til isspanden for at smelte og hjælpe med at afkøle bedøvelsesholderen (f.eks. pipetteboksplade).
- Placer kassetoppen på den smeltede is for at afkøle.
- Fjern forsigtigt hvalpen/hvalpene fra buret og læg dem i den afkølede kassetop, som forbliver på isen. Placer en anden top løst over bunden for at hjælpe køleprocessen.
- Efter 2-3 minutter skal du kontrollere hvalpene. Adskil hvalpene fra hinanden, mens de forbliver i den udsatte position.
BEMÆRK: Hvalpene vil vride sig, men dette vil bremse, når den kolde bedøvelse starter. Bokstoppen kan efterlades for nem visning af hvalpene. - For at kontrollere for korrekt bedøvelse skal du klemme hvalpens hale og kigge efter en reaktion. Hvis der opstår en reaktion, gentages trin 2.2.4. Hvis der ikke foretages hvin eller lidt bevægelse, er hvalpen klar til proceduren.
BEMÆRK: Mus bør ikke holdes på is i længere tid, da dette vil påvirke deres evne til at komme sig efter proceduren. Kun antallet af hvalpe, der både kan injiceres og elektroporeres, mens de stadig er under anæstesi, skal lægges på is ad gangen; Større antal kan gøres med erfaring.
3. Mikroinjektion af DNA-plasmidblanding i hjernens ventrikel
- Placer en hvalp på bordet i ventral position.
- Træk lidt tilbage på bagsiden af hovedet for at visualisere kraniets suturer gennem huden. Find lambda på kraniet. Ventrikel/injektionsstedet vil være midtvejs mellem lambda og øjet.
BEMÆRK: Lambda er, hvor sagittale og lambdoide suturer skærer hinanden. Se reference11 for identifikation af lambda på musekraniet. - Gennembor huden med glaspipettespidsen i en vinkelret vinkel (pipetten er lige op mod loftet). Overhold en let konkav fordybning, når du trykker på kraniet og en indledende modstand. Når den er gennemboret, og glaspipettespidsen stikker gennem den konkave fordybning, nås det passende injektionsniveau.
- Hold glaspipettespidsen på plads, og tryk én gang på mikroinjektorfodpedalen for at injicere 1 μL plasmidblandingen.
BEMÆRK: Der er to måder at tydeligt se, at injektionen var vellykket. Få først et andet laboratoriemedlem til at se plasmidblandingen gå ned i glaspipetten, når den injiceres. Hvis du bruger hurtig grøn eller et andet farvestof i plasmidblandingen, spredes farvestoffet synligt ud i ventriklen under huden, når det er injiceret, og er let synligt, når det holdes op til en kirurgisk lampe.
4. Elektroporation
- Placer et stykke paraffinfilm (en firkant) på bordet og pres elektrodegelen ud oven på filmen. Dæk elektrodepadlerne i elektrodegel ved at børste en generøs mængde på hver padle. Enhver overskydende gel, der drypper af, kan stryges af på et papirhåndklæde.
BEMÆRK: Efter den første EP må du ikke lade gelen fra hver pagaj røre den anden side. Dette overfører ladningen, og når der påføres hvalpens hoved, kan der høres en sydende lyd. Dette vil også ske, hvis gelen på hvalpens hoved fra en elektrode kommer i kontakt med gelen fra en anden.
FORSIGTIG: Der skal udvises forsigtighed for at holde fingrene væk fra padlerne under elektroporationen. - Hold hvalpens krop i den ene hånd (typisk den ikke-dominerende hånd), og hold fingrene godt bag hovedet.
BEMÆRK: Hvis den er højrehåndet, er det nemmest at holde hvalpen med venstre hånd og elektroder med højre. Hvis venstrehåndet, gør det modsatte. - Bring elektroderne tæt på hvalpens hoved for at sikre, at de er i den rigtige position med den positive elektrode på ydersiden af hovedet, hvor ventriklen målrettes (f.eks. Hvis du målretter mod venstre ventrikel, skal du placere den positive på hvalpens venstre side og negativ på hvalpens højre side). Mens du placerer elektroderne, skal du forsigtigt glide en finger (typisk tommelfingeren) på den dorsale side af kroppen / halsen bagved hovedet for at hjælpe med at hæve hovedet på plads.
- Kontroller dybden af anæstesi ved at klemme halen og fortsæt kun med elektroporation, hvis hvalpen er i det passende anæstesiplan. Tryk let på elektrodepadlerne på den rostrale del af musehovedet og placer dem over øjnene. Tryk én gang på elektrodefodpedalen for at starte elektroporationen. Denne protokol bruger fem impulser på 120 V (50 ms, adskilt af 950 ms); Hver puls vil være hørbar.
- Med hver puls drejes elektrodepadlerne lidt mod uret, så den positive padle bevæger sig mod toppen af hovedet.
BEMÆRK: Med korrekt elektroporation vil man føle / se musehvalpens krop rykke med hver puls.
- Med hver puls drejes elektrodepadlerne lidt mod uret, så den positive padle bevæger sig mod toppen af hovedet.
- Efter den sidste puls skal du fjerne padlerne og placere dem til siden. Flyt hvalpen til et rent papirhåndklæde, og få et andet laboratoriemedlem til at rense gelen af hvalpens hoved og placere under en varmelampe på en papirhåndklæde "båd".
BEMÆRK: Sørg for, at varmelampen ikke er for tæt på hvalpene. Sørg for at få et andet laboratoriemedlem til at hjælpe med dette trin, og hold konstant øje med hvalpene. Det hjælper ofte at holde hvalpene i hånden under varmelampen for at øge varmen til hvalpen. Forsigtigt massering af hvalpens underliv kan også hjælpe med genopretning. - Sæt hvalpene tilbage i hjemmeburet, når deres kroppe har en sund lyserød farve og har et knirkende svar på en let haleklemme.
BEMÆRK: Før du sætter dem tilbage i buret, skal du tage en lille mængde af hjemmeburets strøelsesmateriale og børste hvalpene let med det til burets duft. Sæt hvalpene tilbage i buret under strøelsesmaterialet og vend tilbage til staldrummet.
5. Postkirurgiske trin
- Den ubrugte plasmidblanding fra mikroinjektorglaspipetten føres tilbage til røret. Hvis der er nok blanding tilbage, kan dette bruges i fremtidige procedurer. Opbevares ved -20 °C.
- Tør gelen af elektrodepadlerne med køkkenrulle.
- Returner alle udstyrsdele tilbage til deres oprindelige plads.
BEMÆRK: Hvis der blev brugt en saks til at klippe glaspipettespidsen, efter at plasmidblandingen blev taget op, skal saksen rengøres grundigt med DNase-opløsning. - Spray bordet ned med et kemisk desinfektionsmiddel, tør derefter af, efterfulgt af en spray ned på 70% ethanol, og tør derefter af igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor er blevet brugt til med succes at udvikle både pædiatriske og voksne hjernetumormusemodeller, med førstnævnte offentliggjort i omfattende detaljer i Kim et al.8. Med korrekt teknik og omhyggelig planlægning af plasmiddesign er succesen for EP-udvikling af tumorer typisk 100%. Histologi er den hurtigste og nemmeste måde at kontrollere for vellykket DNA-plasmidindsættelse, når der anvendes et reporterprotein. Denne protokol involverer trin til, hvordan man udvikler en GBM hjernetumormodel med 100% penetrans, som bekræftet af histologisk analyse. Et MADR-donorplasmid udtrykte både et reporterprotein (smTagBFP2-V5) og SpCas9 (supplerende fil 1). To stærke driver LOF tumorsuppressor gen single-guide RNA'er (sgRNA'er) blev også inkluderet, rettet mod Nf1 og Trp53 (se reference12 for sgRNA-kloningsstrategi; se supplerende fil 1 for oligonukleotidsekvenser anvendt i denne protokol). Endelig blev Cre- og Flp-rekombinaseplasmiderne tilsat plasmidblandingen til rekombination på Rosa26-locus (figur 1A; se supplerende fil 1). Mus var døende 5 måneder efter EP, med fuld tumorvækst påvist gennem reporterproteinet og histologisk analyse (figur 1B).
Figur 1: Immunofluorescerende farvning af vellykket tumorvækst 5 måneder efter EP . (A) MADR-donorplasmid til spCas9 og reporterproteinet TagBFP2-V5. Også inkluderet i plasmidblandingen var et Cre-Flp-rekombinaseplasmid sammen med sgRNA'er rettet mod Nf1 og Trp53. (B) Et koronalt afsnit taget 5 måneder efter EP af en GBM-tumor drevet af Nf1 og Trp53 LOF. Tumorceller er mærket med TagBFP-V5 reporterprotein forbundet med spCas9 (B3). Sparsom EGFP-mærkning detekteres også (B2) sammen med alle celler, der ikke udtrykte plasmiderne mærket med tdTomato (B1). Skalabjælke = 1.000 μm. Forkortelser: Ctx = cortex; CC = corpus callosum; LV = lateral ventrikel; Str = striatum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Plasmidsekvenser. Komplette sekvenser af alle plasmider og oligonukleotider, der anvendes i denne protokol, herunder pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre og oligonukleotiderne til sgRNA rettet mod Trp53 og Nf1. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporationsbaseret levering af plasmid-DNA muliggør in vivo-anvendelse af molekylærbiologi, svarende til den, der anvendes i genetisk manipulerede musemodeller, men med hastigheden, lokaliseringen og effektiviteten af viral transduktion 8,13,14. Med sidstnævnte kommer imidlertid sikkerhedsproblemer såvel som immunresponser. Vi har vist i vores modelleringssystem ved hjælp af EP-levering af plasmid-DNA, at der opstår minimal immunrespons på grund af den indledende indsættelse af glaskapillærpipetten i hjernens ventrikel8. For at forbedre de nuværende tumormodelleringssystemer til immunterapi giver protokollen ovenfor mulighed for et mere hensigtsmæssigt og robust præklinisk modelleringssystem for hjernetumorer.
Det første afgørende skridt for vellykket hjernetumormodellering ved hjælp af denne metode er plasmiddesign. Selvom det ikke er beskrevet i denne protokol, er det blevet grundigt diskuteret i Kim et al.8 og Rincon Fernandez Pacheco et al.10 til pædiatriske hjernetumormodeller samt andre kilder til yderligere anvendelser15,16. Mens vores laboratorium med succes har elektroporeret op til seks plasmider, vil der være en øvre grænse for, hvor meget DNA der kan leveres. Denne øvre grænse er begrænset af plasmid-DNA-koncentration, plasmidstørrelser, spænding og mængden af leveret DNA, som i sig selv er begrænset af størrelsen af hjerneventriklen i elektroporationsalderen. Derudover er det med flere DNA-plasmider i blandingen bydende nødvendigt at have en godt suspenderet plasmidblanding inden injektion. Hvis blandingen ikke resuspenderes godt, vil det være svært at optage i den smalle glaskapillærpipette. Med den korrekte plasmidblanding muliggør tilsætningen af hurtigt grønt farvestof (10% v / v) også klar visning af plasmidblandingen, der optages i hjerneventriklen under administration (trin 3.4). En vigtig advarsel til dette er imidlertid, at farvestoffet kan forstyrre antistoffarvning i de langt røde bølgelængder (f.eks. Cy5) af væv, der behandles inden for flere uger efter EP8. Selvom det hurtige grønne farvestof er meget nyttigt, når man først lærer EP, kan det elimineres for at undgå falsk-positiv farvning. Det er værd at huske på, at for trin 3.4 vil leveringen af plasmidblandingen i ventriklen ikke være synlig, så det vil være afgørende at se glaspipetten for at volumenet falder, når det injiceres.
For konsistens og korrekt håndtering af injektioner er der flere faktorer at huske på: 1) injektionsvolumen. Selv om det kan tage flere forsøg at skære glaskapillærpipetten nøjagtigt (trin 2.1.2), er det afgørende, at der kun injiceres 1 μL plasmidblanding til hvert dyr. Forøgelser eller fald i volumenet mellem dyr vil helt sikkert påvirke latenstiden af tumordannelse. 2) Når injektionsvolumen er indstillet, må mikroinjektorens parametre ikke ændres, da dette vil påvirke lydstyrken. 3) Når plasmidblandingen er bragt op i glaskapillærpipetten, skal pipetten holdes ude af vejen for ikke ved et uheld at stikke sig selv eller andre. Brug af et mikropipettestativ (loddehjælp; se materialetabel), der klemmes på mikroinjektorholderen, er nyttigt til dette. Men hvis plasmidblandingen ikke injiceres kort efter, vil den sandsynligvis tilstoppe spidsen. Derfor er det vigtigt at lave en test mikroinjektion på et stykke parafilm umiddelbart før injektion i hjernens ventrikel for at sikre, at der ikke er nogen tilstopning, der blokerer åbningen. Endelig, ligesom enhver anden kirurgisk teknik, er udførelsen af protokollen forskellig for hver enkelt person. Det er derfor bydende nødvendigt at have den samme tekniker til at udføre mikroinjektionen og/eller EP for alle grupper af mus i et eksperiment.
De hjernetumormodeller, der er udviklet i vores laboratorium, har fokuseret på gliomer. Fra et neurobiologisk perspektiv er udførelsen af denne metode mellem postnatale dage 0-3 rettet mod gliogeneseperioden og perioden postembryonal neurogenese. Interesse for alternative hjernetumorer kan kræve justering i tidspunktet og / eller placeringen af elektroder. Flere protokoller er tilgængelige for in utero EP, der ville være relevante for neurale baserede tumorer15,17,18.
Der er et par begrænsninger for denne metode. Evnen til at klone og blande og matche både LOF og GOF DNA-plasmider ved hjælp af CRISPR, transposoner og for nylig MADR-systemet gør det muligt at modellere endeløse kombinationer af patientmutationer. Teknikkerne til mikroinjektion og EP er relativt enkle, selvom de tager et par øvelsesforsøg for at forbedre og blive konsistente. En begrænsning af den præsenterede model er den tid, det tager for GBM-tumoren at udvikle sig fuldt ud (5 måneder). På trods af dette arbejder vi i øjeblikket på yderligere modeller ved hjælp af almindelige patienttumormutationer, der fører til aggressiv tumorvækst, der varer mindre end 2 måneder. Ud over begrænsninger er selve udstyret en betydelig initialinvestering (omkring $ 20,000 - $ 30,000); Men evnen til at elektroporate titusindvis, hvis ikke hundredvis af mus i et møde, giver mulighed for utrolig kraft til et præklinisk eksperiment. Når det er sagt, hvis der er problemer med museavl, kan dette blive den største begrænsning, da det er bydende nødvendigt at have sunde opdrættere og sunde kuld.
Det har været flere årtier siden fremskridt i hjernetumor behandlinger har fundet sted, med den sidste største forbedring af kemoterapeutisk Temozolomid forlænger overlevelsen med kun et par måneder19. Immunterapi har revolutioneret mange forskellige kræftformer, men har endnu ikke haft en væsentlig indflydelse på standarden for pleje inden for neuro-onkologi. Interessant nok har aktuelt anvendte musehjernetumormodeller vist stor succes med immunterapi, men undlader løbende at oversætte til klinikken og vise succes med patienter. Det er derfor bydende nødvendigt at tage et skridt tilbage og revurdere de anvendte musetumormodeller. Nuværende modeller afhænger af at bruge ældre cellelinjer med begrænsede mutationer, der ikke almindeligvis findes hos patienter, mens de injicerer tusindvis af celler i hjernen. Med teknikken diskuteret i denne protokol rekapituleres forskellige patienttumormutationsprofiler i en musemodel, hvilket muliggør en autokton, gradvis udvikling af tumorer inden for en tidsramme, der muliggør præklinisk test i immunkompetente mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Gi Bum Kim for den immunfluorescerende farvning og billeder. Vi takker også Emily Hatanaka, Naomi Kobritz og Paul Linesch for nyttige råd om protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
