Summary
전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.
Abstract
종양 모델은 새롭고 더 효과적인 치료법을 탐색하는 측면에서 뇌종양의 전임상 테스트에 매우 중요합니다. 면역 요법에 대한 관심이 높아짐에 따라 뇌의 종양 및 면역 세포 집단과 치료에 대한 반응을 조사하기 위해 일관되고 임상적으로 적절하며 면역력이 있는 마우스 모델을 보유하는 것이 훨씬 더 중요합니다. 대부분의 전임상 모델은 확립된 종양 세포주의 정형외형 이식을 활용하지만, 여기에 제시된 모델링 시스템은 생체 내에서 분열 신경 전구 세포(NPC)에 삽입된 DNA 구조로부터 점진적이지만 효과적인 개발로 환자 특이적 종양 돌연변이의 "개인화된" 표현을 허용합니다. DNA 구조체는 MADR(dual-recombinase-mediated cassette exchange) 방법을 사용한 모자이크 분석을 특징으로 하며, 드라이버 돌연변이의 단일 복제, 체세포 돌연변이 유발을 허용합니다. 출생부터 생후 3일 사이의 갓 태어난 새끼 쥐를 사용하여 NPC는 측면 심실 내벽을 감싸고 있는 이러한 분열 세포를 이용하여 표적이 됩니다. DNA 플라스미드(예: MADR 유래, 트랜스포손, CRISPR 지향 sgRNA)를 심실에 미세주입한 후 머리의 로스트랄 영역을 둘러싸는 패들을 사용하여 전기천공법을 수행합니다. 전기 자극을 받으면 DNA가 분열하는 세포로 흡수되어 게놈에 통합될 가능성이 있습니다. 이 방법의 사용은 가장 흔한 악성 뇌종양인 교모세포종을 포함한 소아 및 성인 뇌종양 발병에서 성공적으로 입증되었습니다. 이 기사에서는 어린 쥐 새끼를 마취하는 절차부터 플라스미드 혼합물의 미세 주입 및 전기 천공법까지 포함하여 이 기술을 사용하여 뇌종양 모델을 개발하는 다양한 단계에 대해 논의하고 시연합니다. 이 자가적이고 면역력이 있는 마우스 모델을 통해 연구자들은 효과적인 암 치료를 개선하고 조사하기 위한 노력의 일환으로 전임상 모델링 접근 방식을 확장할 수 있습니다.
Introduction
쥐 뇌종양 모델은 뇌종양 형성 및 치료의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 현재 모델에는 일반적으로 적절한 면역요법 연구를 방해하는 면역결핍 마우스를 사용하여 제한된 수의 드라이버 돌연변이 또는 환자 유래 이종이식 모델을 기반으로 일반적으로 사용되는 종양 세포주의 신속하게 생산된 피하 또는 기립성 이식이 포함됩니다 1,2,3,4. 또한, 이러한 전임상 결과는 위양성(false positive)으로 이어질 수 있는데, 이는 이러한 모델이 치료에 대한 반응으로 극적이고 종종 치료 효과를 나타낼 수 있다는 점에서, 그러나 이는 임상에 적용되지 않는다 2,5,6,7. 환자의 돌연변이 시그니처를 더 잘 반영하는 유전자 조작 전임상 마우스 모델을 신속하게 생산할 수 있는 능력은 전임상 결과의 타당성을 개선하는 데 필수적입니다.
LOF(loss of function) 및 GOF(gain of function) 돌연변이를 유도하기 위한 DNA 플라스미드의 전기천공법(EP) 기반 전달은 이러한 모델의 생성을 가능하게 합니다. 우리는 이중 재조합 효소 매개 카세트 교환을 통한 모자이크 분석(mosaic analysis with dual-recombinase-mediated cassette exchange, MADR8)이라고 하는 GOF 드라이버 돌연변이를 훨씬 더 정확하게 표현하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 체세포(somatic cells)에서 제어된, 유전자좌(locus-specific) 방식으로 관심 유전자(또는 유전자들)의 발현을 허용한다8. CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)과 같은 다른 분자 도구와 함께 다양한 환자 돌연변이를 결합하여 마우스 뇌종양 모델을 개발할 수 있습니다. 이 방법은 신경교종(gliomas)과 뇌실막종(ependymomas8)을 포함한 다양한 소아 뇌종양과 교모세포종(GBM)과 같은 성인 뇌종양 모델에도 사용되어 왔다.
종양 모델링의 EP 방법은 이식만큼 일반적이지는 않지만, 다음은 지금까지 이 모델링 시스템의 용이성과 높은 재현성을 보여줍니다. mTmG 마우스는 MADR-플라스미드 DNA 8,9의 삽입에 사용됩니다. 이 시스템은 Rosa26 유전자좌에 위치한 loxP 및 Flp 재조합 효소 표적(FRT) 부위의 재조합을 허용하여 donor DNA 플라스미드(즉, 관심 GOF 유전자)의 후속 삽입을 가능하게 합니다8,9. 다음 프로토콜은 부지런한 연습 후에 이 방법의 간단성과 자생적이고 일관된 방식으로 마우스 뇌종양 모델을 개발할 수 있는 능력을 보여줍니다.
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Protocol
이 프로토콜의 모든 절차는 Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 동형접합 mTmG 마우스를 C57BL/6J 마우스와 함께 사육하여 다음 프로토콜에 사용하기 위한 혼합 성별, 이형접합 mTmG 마우스의 새끼를 얻었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었다(자료표 참조). 새끼 마우스는 출생 후 0일과 3일(P0-P3) 사이에 전기천공되었습니다.
1. 수술 설정
- 수술대에 화학 소독제(예: Vimoba)를 뿌리고 닦아낸 다음 70% 에탄올을 묻혀 다시 닦아냅니다.
- 당겨진 유리 모세관 피펫(피펫을 당기는 방법에 대한 참조10 참조), 작은 가위, 작은 생물학적 위험 날카로운 물건 폐기물 용기, 마이크로리터 피펫터 및 피펫 팁, 파라핀 필름의 절단된 정사각형 조각 2개, 전극 겔, 전극, 미세인젝터용 홀더 및 DNA 플라스미드 혼합물( 재료 표 및 보충 파일 1 참조).
- 표시된 경우 수술 테이블 또는 바닥에 있는 장비에 마이크로인젝터 제어판, 홀더 및 플러그, 마이크로인젝터 홀더를 옆으로 고정하기 위한 스탠드(납땜 보조장치), 마이크로인젝터 풋 페달(바닥), 기계에 부착된 전극 및 전극 풋 페달(바닥)( 재료 표 참조).
알림: 전극 풋 페달은 사용 순서를 상기시키기 위해 마이크로인젝터 풋 페달의 오른쪽에 배치되었습니다. - 마이크로인젝터와 전극 제어판을 켭니다.
- 마이크로인젝터의 설정이 실험에 적합한지 확인하십시오: 압력은 플라스미드 혼합물이 흡수되는 방식에 따라 220-450 hPa 사이여야 합니다.
- 전극 패널의 설정이 실험에 맞는지 확인하십시오.
참고: 현재 실험(및 대부분의 뇌종양 모델)에는 120V(50ms, 950ms로 간격)의 5개 펄스가 사용됩니다.
2. 수술 전 준비
- microinjector에서 plasmid mix를 준비합니다.
- 당겨진 유리 모세관 피펫 하나를 회수하여 마이크로인젝터 홀더에 삽입합니다. 팁이 제자리에 고정되도록 나사로 고정되었는지 확인하십시오.
- 한 손에는 마이크로인젝터 홀더를 잡고 다른 한 손으로는 작은 가위를 잡습니다. 작은 날카로운 물건 생물학적 위험 용기 위에 피펫 끝을 놓습니다. 가위를 닫은 상태에서 길쭉한 유리 모세관 피펫을 가볍게 누릅니다. 구부러진 부분이 보이는 곳, 개구부에서 약 2mm 떨어진 곳을 자릅니다. 절단이 성공한 것 같으면 조심스럽게 옆으로 눕힙니다.
- 시중에서 판매되는 플라스미드 혼합 튜브를 수술 테이블 위에 평평하게 놓고 엽니다. 피펫 팁 상자 또는 다른 품목을 튜브 바닥 뒤에 두어 플라스미드 혼합물을 추출하는 동안 안정적으로 유지합니다. 마이크로인젝터 라인에 부착된 유리 피펫을 테이블 위에 평평하게 놓고 플라스미드 혼합물의 튜브에 부드럽게 삽입하여 팁이 튜브 바닥 근처의 혼합물에 잘 들어가도록 합니다.
참고: 자연 중력 흡입으로 인해 플라스미드 혼합물 흡입은 유리 피펫에서 시작되어 능동적으로 흡입됩니다. - 유리 피펫의 끝을 플라스미드 혼합물에 넣고 microinjector 패널을 사용하여 흡입하는 양을 늘립니다. 0에서 시작하여 오른쪽 노브를 돌려 음의 방향으로 -60으로 다이얼하면 플라스미드 혼합물이 유리 피펫으로 이동합니다. ~1인치의 플라스미드 혼합물만 가져오세요. 손잡이를 다시 0으로 돌린 다음 혼합물에서 피펫 팁을 제거합니다.
알림: 혼합물이 마이크로인젝터와 튜브로 발사될 수 있으므로 음의 방향에서 혼합물에서 피펫 팁을 제거하지 마십시오. - 혼합물을 파라핀 필름 스트립 하나에 주입하여 한 번의 주입으로 혼합물의 양을 테스트합니다. 풋 페달을 사용하고 한 번 눌러 혼합물을 파라핀 필름에 주입합니다. 1μL로 설정된 피펫터를 사용하여 파라핀 필름의 혼합물을 취하여 정확히 1μL인지 확인합니다.
알림: 1μL보다 약간 작으면 마이크로인젝터의 압력을 높일 수 있습니다. 압력이 450hPa에 육박하고 여전히 1μL 미만인 경우 유리 피펫 입구가 너무 작으므로 더 다듬어야 합니다. 트리밍하기 전에 플라스미드 혼합물을 튜브에 다시 넣는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 가위에는 여전히 잔여 혼합물이 남아 있으므로 나중에 DNase로 가위를 철저히 청소하여 남아 있는 혼합물을 제거하는 것이 중요합니다. 주입량이 1μL 이상인 경우 새 풀드 글라스 피펫을 사용하여 다듬어야 합니다. 시험량이 정확히 1μL인 경우 유리 피펫 팁은 올바른 크기입니다. - 2.1.4 단계를 반복하여 시술을 위한 추가 플라스미드 혼합물을 끌어오거나 인발된 유리 피펫에 약 2-3인치를 넣습니다. 혼합물이 끝이 보이지 않는 마이크로인젝터에 너무 깊이 들어가지 않도록 하십시오.
참고: 플라스미드 혼합물을 추출할 때, 기포를 피하는 것이 중요합니다. 기포가 있는 경우 풀링 유리 피펫에서 플라스미드 혼합물을 제거하고 다시 시작하여 이 단계를 다시 수행해야 합니다. 존재하는 기포는 강아지의 심실에 주사할 때 다음 단계에 해롭습니다. - 플라스미드 혼합물이 풀링 유리 피펫에 준비된 상태에서 준비된 피펫을 납땜 보조 스탠드의 측면에 놓고 실수로 만지거나 부딪히지 않도록 방해가 되지 않도록 합니다.
- 실험을 위해 동물을 준비하십시오.
- 새끼를 마취하기 위해 얼음 양동이를 준비하십시오. 얼음 양동이에 물을 넣어 녹이고 마취 홀더(예: 피펫 상자 상단)를 식히는 데 도움이 됩니다.
- 녹인 얼음 위에 상자 상단을 올려 식힙니다.
- 케이지에서 강아지를 조심스럽게 꺼내 얼음 위에 남아 있는 식힌 상자 상단에 넣습니다. 냉각 과정을 돕기 위해 다른 상단을 하단 위에 느슨하게 놓습니다.
- 2-3분 후 새끼를 확인하십시오. 엎드린 자세를 유지한 상태에서 새끼를 서로 분리하십시오.
알림: 새끼는 꿈틀거리지만 차가운 마취가 시작되면 속도가 느려집니다. 상자 상단은 강아지를 쉽게 볼 수 있도록 남겨 둘 수 있습니다. - 적절한 마취를 확인하려면 강아지의 꼬리를 꼬집고 반응을 찾으십시오. 반응이 있는 경우 2.2.4단계를 반복합니다. 삐걱거리거나 거의 움직이지 않으면 강아지가 시술을 받을 준비가 된 것입니다.
알림: 마우스는 시술 후 회복 능력에 영향을 미치므로 장기간 얼음 위에 두어서는 안 됩니다. 마취 상태에서 주사 및 전기 천공이 가능한 새끼의 수만 한 번에 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. 경험으로 더 많은 일을 할 수 있습니다.
3. DNA 플라스미드 혼합물을 뇌실에 미세 주입
- 복부 위치의 테이블 위에 강아지를 놓습니다.
- 머리 뒤쪽을 약간 뒤로 당겨 피부를 통해 두개골 봉합사를 시각화합니다. 두개골에서 람다를 찾으십시오. 심실/주사 부위는 람다와 눈의 중간에 있습니다.
알림: Lambda는 시상과 lambdoid 봉합사가 교차하는 곳입니다. 쥐 두개골의 람다 식별에 대해서는 참고 문헌11 을 참조하십시오. - 유리 피펫 팁으로 수직 각도로 피부를 뚫습니다(피펫은 천장을 향해 똑바로 향함). 두개골을 누를 때 약간의 오목한 움푹 들어간 곳과 초기 저항을 관찰하십시오. 피어싱되고 유리 피펫 팁이 오목한 움푹 들어간 곳을 뚫으면 적절한 주입 수준에 도달합니다.
- 유리 피펫 팁을 제자리에 고정하고 마이크로인젝터 풋 페달을 한 번 눌러 1 μL의 플라스미드 혼합물을 주입합니다.
참고: 주입이 성공했는지 명확하게 확인할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 먼저, 다른 실험실 구성원에게 플라스미드 혼합물이 주입될 때 유리 피펫에서 내려가는 것을 관찰하도록 합니다. 또한, 플라스미드 혼합물에 fast green 또는 다른 염료를 사용하는 경우, 주사 시 염료가 피부 아래의 심실에 눈에 띄게 퍼지며 수술용 램프에 대면 쉽게 볼 수 있습니다.
4. 전기천공법
- 파라핀 필름 조각(정사각형 1개)을 테이블 위에 놓고 필름 위에 전극 젤을 짜냅니다. 각 패들에 넉넉한 양을 솔질하여 전극 젤로 전극 패들을 덮습니다. 떨어지는 여분의 젤은 종이 타월로 닦아 낼 수 있습니다.
알림: 첫 번째 EP 후에는 각 패들의 젤이 반대쪽에 닿지 않도록 하십시오. 이렇게 하면 전하가 전달되고 강아지의 머리에 바르면 지글거리는 소리가 들릴 수 있습니다. 이것은 한 전극의 강아지 머리에 있는 젤이 다른 전극의 젤과 접촉하는 경우에도 발생합니다.
주의 : 전기천공법 중에는 손가락이 패들에서 멀리 떨어지도록 주의해야 합니다. - 강아지의 몸을 한 손(일반적으로 자주 사용하지 않는 손)으로 잡고 손가락을 머리 뒤로 잘 유지합니다.
알림: 오른손잡이인 경우 왼손으로 강아지를 잡고 오른손으로 전극을 잡는 것이 가장 쉽습니다. 왼손잡이라면 반대로 하십시오. - 전극을 강아지의 머리 가까이로 가져와 양극이 심실이 표적이 되는 머리 바깥쪽에 있는 올바른 위치에 있는지 확인합니다(예: 좌심실을 대상으로 하는 경우 양극을 강아지의 왼쪽에, 음극을 강아지의 오른쪽에 놓습니다). 전극을 배치하는 동안 머리의 뒤쪽에 있는 몸/목의 등쪽에 있는 손가락(일반적으로 엄지손가락)을 부드럽게 밀어 머리를 제자리로 들어 올립니다.
- 꼬리를 꼬집어 마취 깊이를 확인하고 강아지가 적절한 마취면에 있는 경우에만 전기천공법을 진행합니다. 마우스 헤드의 로스트랄 부분에 있는 전극 패들을 가볍게 눌러 눈 위에 놓습니다. 전극 풋 페달을 한 번 눌러 electroporation을 시작하십시오. 이 프로토콜은 120V(50ms, 950ms로 분리)의 5개 펄스를 사용합니다. 각 맥박이 들립니다.
- 각 펄스에서 전극 패들을 시계 반대 방향으로 약간 돌려 양극 패들이 머리 꼭대기를 향해 이동하도록 합니다.
알림: 적절한 전기천공법을 사용하면 맥박이 뛸 때마다 쥐 강아지의 몸이 경련하는 것을 느끼거나 볼 수 있습니다.
- 각 펄스에서 전극 패들을 시계 반대 방향으로 약간 돌려 양극 패들이 머리 꼭대기를 향해 이동하도록 합니다.
- 마지막 펄스가 끝나면 패들을 제거하고 옆으로 눕힙니다. 강아지를 깨끗한 종이 타월로 옮기고 다른 실험실 구성원이 강아지의 머리에서 젤을 청소하고 종이 타월 "보트"의 열 램프 아래에 놓도록 합니다.
알림: 열 lamp 강아지에게 너무 가깝지 않습니다. 다른 실험실 구성원이 이 단계를 돕고 새끼를 계속 주시해야 합니다. 강아지의 열을 높이기 위해 열 램프 아래에서 강아지를 손에 잡는 것이 종종 도움이 됩니다. 강아지의 복부를 부드럽게 마사지하는 것도 회복에 도움이 될 수 있습니다. - 새끼의 몸이 건강한 분홍빛이 도는 색을 띠고 가벼운 꼬리 꼬집기에 삐걱거리는 반응을 보이면 새끼를 집 케이지로 돌려보냅니다.
알림: 케이지에 다시 넣기 전에 소량의 가정용 케이지 침구 재료를 가져다가 케이지 냄새를 위해 강아지를 가볍게 빗질하십시오. 새끼를 침구 재료 아래의 케이지에 다시 넣고 보관실로 돌아갑니다.
5. 수술 후 단계
- 사용하지 않은 플라스미드 혼합물을 microinjector 유리 피펫에서 튜브로 되돌립니다. 혼합물이 충분히 남아 있으면 향후 절차에서 사용할 수 있습니다. -20 °C에서 보관하십시오.
- 종이 타월로 전극 패들에서 젤을 닦아냅니다.
- 모든 장비 부품을 원래 위치로 되돌립니다.
NOTE: 플라스미드 혼합물을 채취한 후 유리 피펫 팁을 절단하기 위해 가위를 사용한 경우, DNase 용액으로 철저히 세척하기 위해 가위를 그대로 두십시오. - 테이블 위에 화학 소독제를 뿌린 다음 닦아낸 다음 70% 에탄올을 뿌린 다음 다시 닦아냅니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜은 소아 및 성인 뇌종양 마우스 모델을 성공적으로 개발하는 데 사용되었으며, 전자는 Kim et al.8에 광범위하게 상세하게 발표되었습니다. 적절한 기술과 플라스미드 설계의 신중한 계획을 통해 종양의 EP 발달 성공률은 일반적으로 100%입니다. 조직학은 리포터 단백질을 사용할 때 성공적인 DNA 플라스미드 삽입을 확인하는 가장 빠르고 쉬운 방법입니다. 이 프로토콜은 조직학적 분석으로 확인된 바와 같이 100% 침투율로 교모세포종 뇌종양 모델을 개발하는 방법에 대한 단계를 포함합니다. MADR donor plasmid는 reporter 단백질(smTagBFP2-V5)과 SpCas9(Supplementary File 1)를 모두 발현했습니다. Nf1 및 Trp53을 겨냥한 2개의 강력한 드라이버 LOF 종양 억제 유전자 단일 가이드 RNA(sgRNA)도 포함되었습니다(sgRNA 클로닝 전략에 대해서는 참고 문헌12 참조; 이 프로토콜에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열에 대해서는 보충 파일 1 참조). 마지막으로, Cre 및 Flp 재조합효소 플라스미드를 Rosa26 유전자좌에서 재조합하기 위해 플라스미드 혼합물에 첨가하였다(도 1A; 보충 파일 1 참조). 마우스는 EP 후 5개월까지 모사시켰고, 리포터 단백질 및 조직학적 분석을 통해 전체 종양 성장이 감지되었습니다(그림 1B).
그림 1: EP 후 5개월에 성공적인 종양 성장의 면역형광 염색 . (A) spCas9 및 리포터 단백질 TagBFP2-V5에 대한 MADR donor plasmid. 또한 플라스미드 혼합물에는 Nf1 및 Trp53에 유도된 sgRNA와 함께 Cre-Flp 재조합효소 플라스미드가 포함되었습니다. (B) Nf1 및 Trp53 LOF에 의해 유도되는 교모세포종 종양의 EP 후 5개월에 촬영한 관상 절편. 종양 세포는 spCas9(B3)에 연결된 TagBFP-V5 리포터 단백질로 표지됩니다. tdTomato(B1)로 표지된 플라스미드를 발현하지 않은 모든 세포와 함께 희소 EGFP 표지도 검출됩니다(B2). 눈금 막대 = 1,000μm. 약어: Ctx = 피질; CC = 뇌량; LV = 외측 심실; Str = 선조체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 플라스미드 서열. pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre 및 Trp53 및 Nf1을 표적으로 하는 sgRNA용 올리고뉴클레오티드를 포함하여 이 프로토콜에 사용된 모든 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드의 전체 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달은 유전자 조작 마우스 모델에 사용되는 것과 유사하지만 바이러스 형질도입의 속도, 국소화 및 효율성을 갖춘 분자 생물학의 생체 내 사용을 가능하게 합니다 8,13,14. 그러나 후자의 경우 면역 반응뿐만 아니라 안전 문제도 발생합니다. 플라스미드 DNA의 EP 전달을 이용한 모델링 시스템에서 유리 모세관 피펫을 뇌실에 처음 삽입하면 면역 반응이 최소화된다는 것을 보여주었습니다8. 따라서, 면역요법을 위한 현재의 종양 모델링 시스템을 개선하기 위해, 위에 제시된 프로토콜은 뇌종양에 대한 보다 편리하고 강력한 전임상 모델링 시스템을 가능하게 한다.
이 방법을 사용하여 성공적인 뇌종양 모델링을 위한 첫 번째 중요한 단계는 플라스미드 디자인입니다. 본 프로토콜에서는 설명되지 않았지만, 소아 뇌종양 모델에 대한 Kim et al.8 및 Rincon Fernandez Pacheco et al.10 및 추가 용도에 대한 다른 출처에서 광범위하게 논의되었습니다15,16. 우리 연구실은 최대 6개의 플라스미드를 성공적으로 전기천공했지만, 전달할 수 있는 DNA의 양에는 상한선이 있을 것입니다. 이 상한선은 플라스미드 DNA 농도, 플라스미드 크기, 전압 및 전달되는 DNA의 양에 의해 제한되며, 이는 전기천공법 시대의 뇌실 크기에 의해 제한됩니다. 또한, 여러 DNA 플라스미드가 혼합되어 있기 때문에 주입 전에 잘 현탁된 플라스미드 혼합물을 보유하는 것이 필수적입니다. 혼합물이 잘 재현탁되지 않으면 좁은 유리 모세관 피펫에서 흡수하기 어려울 것입니다. 또한, 적절한 플라스미드 혼합물을 사용하면 빠른 녹색 염료(10% v/v)를 첨가하여 투여 중 뇌실에서 흡수된 플라스미드 혼합물을 명확하게 볼 수 있습니다(단계 3.4). 그러나 이에 대한 한 가지 중요한 주의 사항은 염료가 EP8 후 몇 주 이내에 처리된 조직의 원적색 파장(예: Cy5)에서 항체 염색을 방해할 수 있다는 것입니다. 빠른 녹색 염료는 EP를 처음 학습할 때 매우 유용하지만 위양성 염색을 피하기 위해 제거할 수 있습니다. 3.4 단계의 경우 심실에서 플라스미드 혼합물의 전달이 보이지 않으므로 유리 피펫이 주입될 때 부피가 감소하는 것을 관찰하는 것이 중요합니다.
주사의 일관성과 적절한 취급을 위해 명심해야 할 몇 가지 요소가 있습니다: 1) 주입량. 유리 모세관 피펫을 정확하게 절단하기 위해 여러 번의 시도가 필요할 수 있지만(단계 2.1.2), 각 동물에 대해 1μL의 플라스미드 혼합물만 주입하는 것이 중요합니다. 동물 사이의 부피의 증가 또는 감소는 확실히 종양 형성의 잠복기에 영향을 미칩니다. 2) 주입량이 설정되면 부피에 영향을 미치므로 마이크로인젝터의 매개변수를 변경해서는 안 됩니다. 3) 플라스미드 혼합물이 유리 모세관 피펫에 올라오면 피펫이 실수로 자신이나 다른 사람을 찌르지 않도록 방해가 되지 않도록 보관해야 합니다. 이를 위해 마이크로인젝터 홀더에 클립으로 고정하는 마이크로피펫 스탠드(납땜 보조제, 재료 표 참조)를 사용하는 것이 유용합니다. 그러나 플라스미드 혼합물을 바로 주입하지 않으면 팁이 막힐 수 있습니다. 따라서 뇌실에 주사하기 직전에 파라필름 조각에 한 번의 테스트 미세 주입을 수행하여 구멍을 막는 막힘이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 다른 모든 수술 기법과 마찬가지로 프로토콜의 실행은 개인마다 다릅니다. 따라서 실험에서 모든 마우스 그룹에 대해 동일한 기술자가 미세 주입 및/또는 EP를 수행하는 것이 필수적입니다.
우리 연구실에서 개발된 뇌종양 모델은 신경교종에 초점을 맞추고 있습니다. 신경 생물학적 관점에서 출생 후 0-3일 사이에 이 방법을 수행하는 것은 신경교형성 기간과 배아 후 신경발생 기간을 대상으로 합니다. 대체 뇌종양에 대한 관심은 전극의 시점 및/또는 위치의 조정이 필요할 수 있습니다. 자궁 내 EP에 대해 사용할 수 있는 몇 가지 프로토콜이 있으며, 이는 신경 기반 종양에 적합하다15,17,18.
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. CRISPR, transposon, 그리고 최근에는 MADR 시스템을 사용하여 LOF 및 GOF DNA 플라스미드를 모두 복제하고 혼합하여 사용할 수 있는 기능을 통해 환자 돌연변이의 무한한 조합을 모델링할 수 있습니다. 미세 주입 및 EP 기술은 비교적 간단하지만 개선하고 일관성을 유지하기 위해 몇 번의 연습 시도가 필요합니다. 제시된 모델의 한 가지 한계는 교모세포종 종양이 완전히 발달하는 데 걸리는 시간(5개월)입니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 현재 2개월 미만으로 지속되는 공격적인 종양 성장을 유발하는 일반적인 환자 종양 돌연변이를 사용하여 추가 모델을 연구하고 있습니다. 제한 사항 외에도 장비 자체는 상당한 초기 투자(약 $20,000-$30,000)입니다. 그러나 한 번에 수백 마리는 아니더라도 수십 마리의 쥐를 전기할 수 있는 능력은 전임상 실험에 놀라운 힘을 발휘할 수 있습니다. 즉, 마우스 번식에 문제가 있는 경우 건강한 육종가와 건강한 새끼를 보유하는 것이 필수적이기 때문에 이것이 가장 큰 한계가 될 수 있습니다.
뇌종양 치료법이 발전한 지 수십 년이 지났으며, 화학요법제인 테모졸로마이드(Temozolomide)의 가장 큰 개선은 생존 기간을 단 몇 개월 연장시켰다19. 면역 요법은 다양한 암에 혁명을 일으켰지만 신경 종양학의 치료 표준에는 아직 큰 영향을 미치지 못했습니다. 흥미롭게도, 현재 사용되는 마우스 뇌종양 모델은 면역 요법에서 큰 성공을 거두었지만 임상에 적용되어 환자에게 성공을 거두지 못했습니다. 따라서 한 걸음 물러서서 사용된 마우스 종양 모델을 재평가하는 것이 필수적입니다. 현재 모델은 수천 개의 세포를 뇌에 주입하면서 환자에게서 흔히 발견되지 않는 제한된 돌연변이를 가진 오래된 세포주를 사용하는 데 의존합니다. 이 프로토콜에서 논의된 기술을 사용하면 마우스 모델에서 다양한 환자 종양 돌연변이 프로필을 재현하여 면역 능력이 있는 마우스에서 전임상 테스트를 수행할 수 있는 시간 프레임 내에서 종양의 자가적이고 점진적인 발달을 허용합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
면역형광 염색과 영상을 제공해주신 김기범님께 감사드립니다. 또한 프로토콜에 대한 유용한 조언을 해주신 Emily Hatanaka, Naomi Kobritz 및 Paul Linesch에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
