Summary
Bruk av en immunkompetent, autoktonøs tumormodell drevet av vanlige pasientmutasjoner for preklinisk testing er kritisk for immunterapeutisk testing. Denne protokollen beskriver en metode for å generere hjernesvulstmusemodeller ved hjelp av elektroporasjonsbasert levering av plasmid-DNA som representerer vanlige pasientmutasjoner, og gir dermed en nøyaktig, reproduserbar og konsistent musemodell.
Abstract
Tumormodeller er kritiske for preklinisk testing av hjernesvulster når det gjelder å utforske nye, mer effektive behandlinger. Med betydelig interesse for immunterapi er det enda mer kritisk å ha en konsistent, klinisk relevant, immunkompetent musemodell for å undersøke svulst- og immuncellepopulasjonene i hjernen og deres respons på behandlingen. Mens de fleste prekliniske modeller benytter ortotopisk transplantasjon av etablerte tumorcellelinjer, tillater modelleringssystemet som presenteres her en "personlig" representasjon av pasientspesifikke tumormutasjoner i en gradvis, men effektiv utvikling fra DNA-konstruksjoner satt inn i delende nevrale forløperceller (NPC) in vivo. DNA-konstruksjoner har mosaikkanalysen med metoden dual-recombinase-mediert kassettutveksling (MADR), som muliggjør enkeltkopi, somatisk mutagenese av drivermutasjoner. Ved å bruke nyfødte musevalper mellom fødsel og 3 dager gammel, blir NPCer målrettet ved å dra nytte av disse delende cellene som fôrer laterale ventrikler. Mikroinjeksjon av DNA-plasmider (f.eks. MADR-avledede, transposoner, CRISPR-rettet sgRNA) i ventriklene etterfølges av elektroporering ved hjelp av padler som omgir rostralområdet av hodet. Ved elektrisk stimulering tas DNA opp i de delende cellene, med potensial for å integreres i genomet. Bruken av denne metoden har blitt demonstrert i utviklingen av både pediatriske og voksne hjernesvulster, inkludert den vanligste ondartede hjernesvulsten, glioblastom. Denne artikkelen diskuterer og demonstrerer de forskjellige trinnene for å utvikle en hjernesvulstmodell ved hjelp av denne teknikken, inkludert prosedyren for bedøvelse av unge musevalper, til mikroinjeksjon av plasmidblandingen, etterfulgt av elektroporering. Med denne autochthonous, immunokompetente musemodellen vil forskere ha muligheten til å utvide prekliniske modelleringsmetoder, i arbeidet med å forbedre og undersøke effektiv kreftbehandling.
Introduction
Murine hjernesvulst modeller er avgjørende for å forstå mekanismene for hjernesvulst dannelse og behandling. Nåværende modeller inkluderer vanligvis raskt produserte subkutane eller ortotopiske transplantasjoner av vanlig brukte tumorcellelinjer, basert på et begrenset antall drivermutasjoner eller pasientavledede xenograftmodeller, ved bruk av immundefekte mus som hindrer riktige immunterapistudier 1,2,3,4. I tillegg kan disse prekliniske resultatene føre til falske positive, ved at slike modeller kan vise dramatiske, ofte kurative effekter som respons på terapi, men dette oversetter ikke til klinikken 2,5,6,7. Å ha evnen til raskt å produsere genetisk konstruerte prekliniske musemodeller som er mer reflekterende for pasientens mutasjonssignaturer, er avgjørende for å forbedre gyldigheten av prekliniske resultater.
Elektroporering (EP) -basert levering av DNA-plasmider for å indusere både tap av funksjon (LOF) og gevinst av funksjon (GOF) mutasjoner tillater generering av slike modeller. Vi utviklet en metode for en enda mer presis representasjon av GOF-drivermutasjoner kalt mosaikkanalyse med dual-recombinase-mediert kassettutveksling, eller MADR8. Denne metoden tillater ekspresjon av et gen (eller gener) av interesse på en kontrollert, locus-spesifikk måte i somatiske celler8. I kombinasjon med andre molekylære verktøy, for eksempel grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR), kan forskjellige pasientmutasjoner kombineres for å utvikle musehjernesvulstmodeller. Denne metoden har blitt brukt til forskjellige pediatriske hjernesvulster, inkludert gliomer og ependymomas8, samt voksne hjernesvulstmodeller, som glioblastom (GBM).
Mens EP-metoden for tumormodellering ikke er like vanlig som en transplantasjon, demonstrerer følgende hittil den enkle og høye reproduserbarheten til dette modelleringssystemet. mTmG-mus brukes til innsetting av MADR-plasmid-DNA 8,9. Dette systemet tillater rekombinasjon av loxP- og Flp-rekombinasemålsteder (FRT) lokalisert ved Rosa26-lokuset for senere innsetting av donor-DNA-plasmidet (dvs. GOF-genet av interesse)8,9. Følgende protokoll demonstrerer enkelheten av denne metoden etter flittig praksis, og evnen til å utvikle mus hjernesvulst modeller på en autochthonous, konsekvent måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer i denne protokollen ble godkjent av Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Homozygote mTmG-mus ble avlet med C57BL/6J-mus for å oppnå kull av heterozygote mTmG-mus med blandet kjønn for bruk i følgende protokoll. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). Musevalper ble elektroporert mellom postnatal dag 0 og 3 (P0-P3).
1. Kirurgisk oppsett
- Spray ned operasjonsbordet med kjemisk desinfeksjonsmiddel (f.eks. Vimoba) og tørk av, etterfulgt av 70% etanol, og tørk av igjen.
- Plasser følgende instrumenter/materialer på operasjonsbordet: kapillærpipetter av trukket glass (se referanse10 om hvordan du trekker pipetter), liten saks, liten avfallsbeholder for biohazard-skarpe gjenstander, mikroliters pipettor- og pipettespisser, 2x kuttede firkantede stykker parafinfilm, elektrodegel, elektroder, holder til mikroinjektoren og DNA-plasmidblanding (se materialfortegnelse og tilleggsfil 1).
- Plasser følgende vedlegg på utstyret på operasjonsbordet eller på gulvet når det er angitt: mikroinjektorkontrollpanel, holder og plugg festet til maskinen, stativ for å holde mikroinjektorholderen til siden (loddehjelp), mikroinjektorfotpedal (på gulvet), elektroder festet til maskinen og elektrodefotpedal (på gulvet) (se materialfortegnelse).
MERK: Elektrodefotpedalen ble plassert til høyre for mikroinjektorens fotpedal som en påminnelse om bruksrekkefølgen. - Slå på mikroinjektor- og elektrodekontrollpanelene.
- Kontroller at innstillingene på mikroinjektoren er riktige for forsøket: trykket må være mellom 220-450 hPa, avhengig av hvordan plasmidblandingen tas opp.
- Kontroller at innstillingene på elektrodepanelet er riktige for eksperimentet.
MERK: For det nåværende eksperimentet (og de fleste av våre hjernesvulstmodeller) brukes fem pulser på 120 V (50 ms; atskilt med 950 ms).
2. Pre-kirurgisk forberedelse
- Forbered plasmidblandingen i mikroinjektoren.
- Hent en trukket kapillærpipette av glass og sett den inn i mikroinjektorholderen. Forsikre deg om at spissen er skrudd på for å holde på plass.
- Hold mikroinjektorholderen i den ene hånden og den lille saksen med den andre; Ha pipettspissen over en liten beholder for biohazard for skarpe gjenstander. Med saksen lukket, trykk lett ned på den forlengede glasskapillærpipetten. Klipp der bøyningen sees, ca. 2 mm fra åpningen. Hvis kuttet ser vellykket ut, plasser forsiktig til siden.
- Plasser det kommersielt tilgjengelige plasmidblandingsrøret flatt på operasjonsbordet og åpne. Ha pipettespissboksen eller en annen gjenstand bak bunnen av røret for å holde den stabil mens du trekker opp plasmidblandingen. Plasser glasspipetten som er festet til mikroinjektorlinjen flatt på bordet og sett forsiktig inn i røret i plasmidblandingen, og pass på at spissen er godt i blandingen nær bunnen av røret.
MERK: På grunn av naturlig tyngdekraftssug vil sugingen av plasmidblandingen begynne i glasspipetten før den trekkes aktivt inn. - Med spissen av glasspipetten i plasmidblandingen, bruk mikroinjektorpanelet for å øke mengden som trekkes inn. Fra 0, vri høyre knapp og ring i negativ retning mot -60-dette vil bringe plasmidblandingen inn i glasspipetten. Bare ta i ~ 1 tomme av plasmid mix. Vri knappen tilbake til 0, og fjern deretter pipettespissen fra blandingen.
MERK: Ikke fjern pipettespissen fra blandingen mens den er i negativ retning, da dette vil skyte blandingen inn i mikroinjektoren og muligens inn i slangen. - Test mengden blanding i en injeksjon ved å injisere blandingen på en stripe parafinfilm. Bruk fotpedalen og trykk én gang for å injisere blandingen på parafinfilmen. Bruk pipettorsettet ved 1 μL for å ta opp blandingen på parafinfilmen for å se om den er nøyaktig 1 μL.
MERK: Hvis det er litt mindre enn 1 μL, kan mikroinjektorens trykk økes. Hvis trykket nærmer seg 450 hPa og fortsatt mindre enn 1 μL, er glasspipettåpningen for liten og må trimmes mer. Det anbefales å plassere plasmidblandingen tilbake i røret før trimming. Til tross for dette vil det fortsatt være en restblanding på saksen, så det er viktig å rengjøre saksen grundig etterpå med DNase for å fjerne gjenværende blanding. Hvis injeksjonen er over 1 μL, må en ny trukket glasspipette brukes og trimmes. Når testmengden er nøyaktig 1 μL, er glasspipettespissen i riktig størrelse. - Gjenta trinn 2.1.4 for å trekke inn ytterligere plasmidblanding for prosedyren, eller omtrent 2-3 tommer inn i den trukne glasspipetten. Forsikre deg om at blandingen ikke går for langt inn i mikroinjektoren der man ikke kan se enden.
MERK: Når du tegner i plasmidblandingen, er det viktig å unngå luftbobler. Hvis det er bobler, er det nødvendig å gjenta dette trinnet ved å fjerne plasmidblandingen fra den trukne glasspipetten og starte på nytt. Luftbobler som er tilstede vil være skadelige for følgende trinn når de injiseres i valpens ventrikkel. - Med plasmidblandingen klar i den trukne glasspipetten, plasser den klargjorte pipetten til siden på loddehjelpestativet og ut av veien for ikke å berøre/støte den ved et uhell.
- Forbered dyrene på forsøket.
- Forbered en isbøtte for bedøvelse av valper. Tilsett vann i isbøtta for å smelte og bidra til å avkjøle bedøvelsesholderen (f.eks. pipettebokstoppen).
- Plasser bokstoppen på den smeltede isen for å avkjøles.
- Fjern forsiktig valpen (e) fra buret og legg dem i den avkjølte bokstoppen, som forblir på isen. Plasser en annen topp løst over bunnen for å hjelpe kjøleprosessen.
- Etter 2-3 min, sjekk på valpene. Skill valpene fra hverandre mens de forblir i utsatt stilling.
MERK: Valpene vil vri seg, men dette vil avta når kuldebedøvelsen slår inn. Bokstoppen kan utelates for enkel visning av valpene. - For å sjekke om riktig anestesi, klem halen på valpen og se etter en reaksjon. Hvis det kommer en reaksjon, gjenta trinn 2.2.4. Hvis det ikke gjøres squeal eller liten bevegelse, er valpen klar for prosedyren.
MERK: Mus bør ikke holdes på is i lengre perioder, da dette vil påvirke deres evne til å komme seg etter inngrepet. Bare antall valper som kan både injiseres og elektroporeres mens de fortsatt er under anestesi, må legges på is om gangen; Større tall kan gjøres med erfaring.
3. Mikroinjeksjon av DNA-plasmidblanding i hjerneventrikkelen
- Legg en valp på bordet i ventral stilling.
- Trekk litt tilbake på baksiden av hodet for å visualisere skallen suturer gjennom huden. Finn lambda på skallen. Ventrikkelen/injeksjonsstedet vil være midt mellom lambda og øyet.
MERK: Lambda er der sagittal og lambdoid suturer krysser. Se referanse11 for identifisering av lambda på museskallen. - Stikk hull på huden med glasspipettespissen vinkelrett (pipetten er rett opp mot taket). Vær oppmerksom på en liten konkav innrykk når du trykker på skallen og en innledende motstand. Når den er gjennomboret og glasspipettespissen stikker gjennom den konkave fordypningen, nås riktig injeksjonsnivå.
- Hold glasspipettespissen på plass og trykk på mikroinjektorens fotpedal én gang for å injisere 1 μL av plasmidblandingen.
MERK: Det er to måter å tydelig se at injeksjonen var vellykket. La først et annet laboratoriemedlem se plasmidblandingen gå ned i glasspipetten når den injiseres. Også, hvis du bruker rask grønn eller et annet fargestoff i plasmidblandingen, vil fargestoffet synlig spre seg ut i ventrikkelen under huden når det er injisert og er lett synlig når det holdes opp til en kirurgisk lampe.
4. Elektroporering
- Legg et stykke parafinfilm (en firkant) på bordet og press ut elektrodegelen på toppen av filmen. Dekk elektrodeårene i elektrodegel ved å pensle en sjenerøs mengde på hver padle. Eventuell overflødig gel som drypper av, kan sveipes av på et papirhåndkle.
MERK: Etter den første EP-en må du ikke la gelen fra hver åre berøre den andre siden. Dette vil overføre ladningen, og når den påføres valpens hode, kan det høres en fresende lyd. Dette vil også skje hvis gelen på valpens hode fra en elektrode kommer i kontakt med gelen fra en annen.
FORSIKTIG: Det må utvises forsiktighet for å holde fingrene borte fra padlene under elektroporeringen. - Hold valpens kropp i den ene hånden (vanligvis den ikke-dominerende hånden), og hold fingrene godt bak hodet.
MERK: Hvis den er høyrehendt, er det enklest å holde valpen med venstre hånd og elektroder med høyre. Hvis venstrehendt, gjør det motsatte. - Før elektrodene nær valpens hode for å sikre at de er i riktig posisjon, med den positive elektroden på utsiden av hodet der ventrikkelen blir målrettet (f.eks. hvis du retter deg mot venstre ventrikkel, plasser den positive på valpens venstre side og negativ på valpens høyre side). Mens du plasserer elektrodene, skyver du forsiktig en finger (vanligvis tommelen) på dorsalsiden av kroppen/nakken bakover hodet for å bidra til å heve hodet på plass.
- Kontroller dybden av anestesi ved å klemme halen og fortsett med elektroporering bare hvis valpen er i riktig anestesiplan. Klem lett på elektrodepadlene på rostraldelen av musehodet, plasser dem over øynene. Trykk på elektrodefotpedalen én gang for å starte elektroporeringen. Denne protokollen bruker fem pulser på 120 V (50 ms, atskilt med 950 ms); Hver puls vil være hørbar.
- Med hver puls, roter elektrodepadlene litt mot klokken slik at den positive padlen beveger seg mot toppen av hodet.
MERK: Med riktig elektroporering vil man føle / se musen valpens kropp rykke med hver puls.
- Med hver puls, roter elektrodepadlene litt mot klokken slik at den positive padlen beveger seg mot toppen av hodet.
- Etter den endelige pulsen, fjern padlene og legg til siden. Flytt valpen til et rent papirhåndkle og få et annet laboratoriemedlem til å rense gelen av valpens hode og legg under en varmelampe på en papirhåndklebåt.
MERK: Forsikre deg om at varmelampen ikke er for nær valpene. Sørg for at et annet laboratoriemedlem hjelper til med dette trinnet og holder et konstant øye med valpene. Det hjelper ofte å holde valpene i hånden under varmelampen for å øke varmen til valpen. Forsiktig massering av valpens underliv kan også hjelpe med utvinning. - Sett valpene tilbake til hjemmeburet når kroppene deres har en sunn rosa farge og har en knirkende respons på en lys haleklype.
NOTAT: Før du plasserer dem tilbake i buret, ta en liten mengde av hjemmeburets sengetøymateriale og børst valpene lett med det for burduften. Plasser valpene tilbake i buret under sengetøymaterialet og gå tilbake til oppbevaringsrommet.
5. Post-kirurgiske trinn
- Sett den ubrukte plasmidblandingen fra mikroinjektorglasspipetten tilbake til slangen. Hvis det er nok blanding igjen, kan dette brukes i fremtidige prosedyrer. Oppbevares ved -20 °C.
- Tørk gelen av elektrodepadlene med papirhåndklær.
- Returner alle utstyrsdeler tilbake til sitt opprinnelige sted.
MERK: Hvis saks ble brukt til å kutte glasspipettespissen etter at plasmidblandingen ble tatt opp, la saksen stå ute for å rengjøre grundig med DNase-løsning. - Spray ned bordet med et kjemisk desinfeksjonsmiddel, tørk deretter av, etterfulgt av en spray ned med 70% etanol, og tørk deretter av igjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor har blitt brukt til å utvikle både pediatriske og voksne hjernesvulstmusemodeller, med førstnevnte publisert i omfattende detalj i Kim et al.8. Med riktig teknikk og nøye planlegging av plasmiddesign, er suksessen for EP-utvikling av svulster vanligvis 100%. Histologi er den raskeste og enkleste måten å sjekke for vellykket DNA-plasmidinnsetting når et reporterprotein brukes. Denne protokollen innebærer trinn for hvordan man utvikler en GBM hjernesvulstmodell med 100% penetrans, som bekreftet av histologisk analyse. MADR-donorplasmid uttrykte både reporterprotein (smTagBFP2-V5) og SpCas9 (tilleggsfil 1). To sterke driver-LOF-tumorsuppressorgen-enkeltguide-RNA (sgRNA) ble også inkludert, rettet mot Nf1 og Trp53 (se referanse12 for sgRNA-kloningsstrategi; se tilleggsfil 1 for oligonukleotidsekvenser brukt i denne protokollen). Til slutt ble Cre og Flp rekombinaseplasmider tilsatt plasmidblandingen for rekombinasjon ved Rosa26-lokuset (figur 1A; se tilleggsfil 1). Mus var døende 5 måneder etter EP, med full tumorvekst påvist gjennom reporterprotein og histologisk analyse (figur 1B).
Figur 1: Immunfluorescerende farging av vellykket tumorvekst 5 måneder etter EP . (A) MADR-donorplasmid for spCas9 og reporterproteinet TagBFP2-V5. Også inkludert i plasmidblandingen var et Cre-Flp rekombinaseplasmid, sammen med sgRNA rettet mot Nf1 og Trp53. (B) En koronal seksjon tatt 5 måneder etter EP av en GBM-tumor drevet av Nf1 og Trp53 LOF. Tumorceller er merket med TagBFP-V5 reporterprotein knyttet til spCas9 (B3). Sparsom EGFP-merking oppdages også (B2) sammen med alle celler som ikke uttrykte plasmidene merket med tdTomato (B1). Skala bar = 1,000 μm. Forkortelser: Ctx = cortex; CC = corpus callosum; LV = lateral ventrikel; Str = striatum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Plasmidsekvenser. Komplette sekvenser av alle plasmider og oligonukleotider som brukes i denne protokollen, inkludert pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre, og oligonukleotidene for sgRNA rettet mot Trp53 og Nf1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporasjonsbasert levering av plasmid-DNA tillater in vivo bruk av molekylærbiologi, lik den som brukes i genetisk konstruerte musemodeller, men med hastigheten, lokaliseringen og effektiviteten av viral transduksjon 8,13,14. Med sistnevnte kommer imidlertid sikkerhetsproblemer så vel som immunresponser. Vi har vist i vårt modelleringssystem ved bruk av EP-levering av plasmid-DNA at minimal immunrespons oppstår på grunn av den første innsettingen av glasskapillærpipetten i hjerneventrikkelen8. Derfor, for å forbedre dagens tumormodelleringssystemer for immunterapi, tillater protokollen presentert ovenfor et mer hensiktsmessig og robust preklinisk modelleringssystem for hjernesvulster.
Det første avgjørende trinnet for vellykket hjernesvulst modellering ved hjelp av denne metoden er plasmid design. Selv om det ikke er beskrevet i denne protokollen, har det blitt grundig diskutert i Kim et al.8 og Rincon Fernandez Pacheco et al.10 for pediatriske hjernesvulstmodeller, samt andre kilder for ytterligere bruk15,16. Mens laboratoriet vårt har lykkes med elektroporering av opptil seks plasmider, vil det være en øvre grense for hvor mye DNA som kan leveres. Denne øvre grensen er begrenset av plasmid-DNA-konsentrasjon, plasmidstørrelser, spenning og volumet av DNA som leveres, som i seg selv er begrenset av størrelsen på hjerneventrikkelen i en alder av elektroporering. I tillegg, med flere DNA-plasmider i blandingen, er det viktig å ha en godt suspendert plasmidblanding før injeksjon. Hvis blandingen ikke resuspenderes godt, vil det være vanskelig å ta opp i den smale glasskapillærpipetten. Med riktig plasmidblanding gir tilsetning av raskt grønt fargestoff (10 % v/v) også klar visning av plasmidblandingen som tas opp i hjerneventrikkelen under administrasjon (trinn 3.4). En viktig advarsel til dette er imidlertid at fargestoffet kan forstyrre antistofffarging i de langt røde bølgelengder (f.eks. Cy5) av vev behandlet innen flere uker etter EP8. Selv om det raske grønne fargestoffet er veldig nyttig når du først lærer EP, kan det elimineres for å unngå falsk positiv farging. Det er verdt å huske på at for trinn 3.4 vil leveringen av plasmidblandingen i ventrikkelen ikke være synlig, så det vil være avgjørende å se glasspipetten for at volumet skal reduseres når det injiseres.
For konsistens og riktig håndtering av injeksjoner er det flere faktorer å huske på: 1) injeksjonsvolumet. Selv om det kan ta flere forsøk å kutte glasskapillærpipetten nøyaktig (trinn 2.1.2), er det avgjørende at bare 1 μl plasmidblanding injiseres for hvert dyr. Øker eller reduserer volumet mellom dyr vil sikkert påvirke latensen av tumordannelse. 2) Når injeksjonsvolumet er innstilt, må parametrene til mikroinjektoren ikke endres, da dette vil påvirke volumet. 3) Når plasmidblandingen er brakt opp i glasskapillærpipetten, bør pipetten holdes ute av veien for ikke å stikke seg selv eller andre ved et uhell. Bruk av et mikropipettestativ (loddehjelp; se materialfortegnelse) som klemmes på mikroinjektorholderen er nyttig for dette. Men hvis plasmidblandingen ikke injiseres kort tid etter, vil den sannsynligvis tette spissen. Derfor er det viktig å gjøre en test mikroinjeksjon på et stykke parafilm umiddelbart før injeksjon i hjerneventrikkelen for å sikre at det ikke er noen tette blokkerer åpningen. Til slutt, i likhet med alle andre kirurgiske teknikker, er utførelsen av protokollen forskjellig for hver enkelt person. Det er derfor viktig å ha samme tekniker som utfører mikroinjeksjon og / eller EP for alle grupper av mus i et eksperiment.
Hjernesvulstmodellene utviklet i vårt laboratorium har fokusert på gliomer. Fra et nevrobiologisk perspektiv er denne metoden mellom postnatale dager 0-3 rettet mot gliogeneseperioden og perioden etter embryonal neurogenese. Interesse for alternative hjernesvulster kan kreve justering i tidspunkt og / eller posisjon av elektroder. Flere protokoller er tilgjengelige for in utero EP som vil være relevante for nevrale svulster15,17,18.
Det er noen begrensninger for denne metoden. Evnen til å klone og blande og matche både LOF og GOF DNA-plasmider ved hjelp av CRISPR, transposoner og, mer nylig, gjør MADR-systemet det mulig å modellere endeløse kombinasjoner av pasientmutasjoner. Teknikkene for mikroinjeksjon og EP er relativt enkle, selv om de tar noen øvelsesforsøk for å forbedre og bli konsistente. En begrensning av modellen som presenteres er hvor lang tid det tar for GBM-svulsten å utvikle seg fullt ut (5 måneder). Til tross for dette jobber vi for tiden med flere modeller ved hjelp av vanlige pasienttumormutasjoner som fører til aggressiv tumorvekst som varer mindre enn 2 måneder. I tillegg til begrensninger er utstyret i seg selv en betydelig innledende investering (rundt $ 20.000 - $ 30.000); Imidlertid gir evnen til å elektroporere titalls om ikke hundrevis av mus i en sittende utrolig kraft for et preklinisk eksperiment. Når det er sagt, hvis det er problemer med museavl, kan dette bli den største begrensningen, da det er viktig å ha sunne oppdrettere og sunne kull.
Det har vært flere tiår siden fremskritt i hjernesvulstbehandlinger har skjedd, med den siste største forbedringen av kjemoterapeutisk Temozolomide som forlenger overlevelsen med bare noen få måneder19. Immunterapi har revolusjonert mange forskjellige kreftformer, men har ennå ikke gjort en betydelig innvirkning på standarden på omsorg i nevro-onkologi. Interessant, for tiden brukte mus hjernesvulst modeller har vist stor suksess med immunterapi, men kontinuerlig unnlater å oversette til klinikken og vise suksess med pasienter. Det er derfor viktig å ta et skritt tilbake og revurdere musetumormodellene som brukes. Nåværende modeller er avhengige av å bruke eldre cellelinjer med begrensede mutasjoner som ikke vanligvis finnes hos pasienter mens de injiserer tusenvis av celler i hjernen. Med teknikken diskutert i denne protokollen, blir forskjellige pasienttumormutasjonsprofiler i en musemodell rekapitulert, noe som muliggjør en autokton, gradvis utvikling av svulster innenfor en tidsramme som vil tillate preklinisk testing hos immunkompetente mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Gi Bum Kim for immunfluorescerende farging og bilder. Vi takker også Emily Hatanaka, Naomi Kobritz og Paul Linesch for nyttige råd om protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
