Summary
يعد استخدام نموذج الورم الأصلي المختص بالمناعة والمدفوع بطفرات المريض الشائعة للاختبار قبل السريري أمرا بالغ الأهمية لاختبارات العلاج المناعي. يصف هذا البروتوكول طريقة لتوليد نماذج فأر ورم في المخ باستخدام التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي للحمض النووي البلازميد الذي يمثل طفرات المريض الشائعة ، وبالتالي توفير نموذج فأر دقيق وقابل للتكرار ومتسقة.
Abstract
تعد نماذج الأورام ضرورية للاختبار قبل السريري لأورام الدماغ من حيث استكشاف علاجات جديدة أكثر فعالية. مع الاهتمام الكبير بالعلاج المناعي ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نموذج فأر متسق ووثيق الصلة سريريا ومختص بالمناعة لفحص الورم ومجموعات الخلايا المناعية في الدماغ واستجابتها للعلاج. في حين أن معظم النماذج قبل السريرية تستخدم زرع تقويم العظام لخطوط الخلايا السرطانية المنشأة ، فإن نظام النمذجة المقدم هنا يسمح بتمثيل "شخصي" لطفرات الورم الخاصة بالمريض في تطور تدريجي ولكنه فعال من تركيبات الحمض النووي التي يتم إدخالها في خلايا السلائف العصبية المنقسمة (NPCs) في الجسم الحي. تتميز تركيبات الحمض النووي بتحليل الفسيفساء باستخدام طريقة تبادل الكاسيت المزدوج بوساطة إعادة التركيب (MADR) ، مما يسمح بطفرات جسدية أحادية النسخة لطفرات المحرك. باستخدام صغار الفئران حديثي الولادة بين الولادة وعمر 3 أيام ، يتم استهداف الشخصيات غير القابلة للعب من خلال الاستفادة من هذه الخلايا المنقسمة التي تبطن البطينين الجانبيين. الحقن المجهري لبلازميدات الحمض النووي (على سبيل المثال ، مشتقة من MADR ، ترانسبوزونات ، sgRNA الموجهة لكريسبر) في البطينين يتبعها التثقيب الكهربائي باستخدام المجاذيف التي تحيط بمنطقة المنقار في الرأس. عند التحفيز الكهربائي ، يتم امتصاص الحمض النووي في الخلايا المنقسمة ، مع إمكانية الاندماج في الجينوم. تم إثبات استخدام هذه الطريقة بنجاح في تطوير كل من أورام الدماغ لدى الأطفال والبالغين ، بما في ذلك ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا ، الورم الأرومي الدبقي. تناقش هذه المقالة وتوضح الخطوات المختلفة لتطوير نموذج ورم في المخ باستخدام هذه التقنية ، بما في ذلك إجراء تخدير صغار الفئران ، إلى الحقن المجهري لمزيج البلازميد ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي. مع هذا النموذج الأصلي للفأر المناعي ، سيكون لدى الباحثين القدرة على توسيع مناهج النمذجة قبل السريرية ، في محاولة لتحسين وفحص علاج السرطان الفعال.
Introduction
تعد نماذج أورام دماغ الفئران ضرورية لفهم آليات تكوين ورم الدماغ وعلاجه. تتضمن النماذج الحالية عادة عمليات زرع تحت الجلد أو تقويم العظام سريعة الإنتاج لخطوط الخلايا السرطانية شائعة الاستخدام ، بناء على عدد محدود من الطفرات الدافعة أو نماذج xenograft المشتقة من المريض ، باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة والتي تعيق دراسات العلاج المناعي المناسبة1،2،3،4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه النتائج قبل السريرية إلى إيجابيات كاذبة ، حيث يمكن أن تظهر هذه النماذج تأثيرات علاجية دراماتيكية في كثير من الأحيان استجابة للعلاج ، ولكن هذا لا يترجم إلىالعيادة 2،5،6،7. إن امتلاك القدرة على الإنتاج السريع لنماذج الفئران قبل السريرية المعدلة وراثيا والتي تعكس بشكل أكبر توقيعات طفرات المريض أمر حتمي لتحسين صحة النتائج قبل السريرية.
يسمح التوصيل القائم على التثقيب الكهربائي (EP) لبلازميدات الحمض النووي للحث على كل من فقدان الوظيفة (LOF) واكتساب الوظيفة (GOF) بتوليد مثل هذه النماذج. لقد طورنا طريقة لتمثيل أكثر دقة لطفرات محرك GOF تسمى تحليل الفسيفساء مع تبادل الكاسيت بوساطة إعادة التركيب المزدوج ، أو MADR8. تسمح هذه الطريقة بالتعبير عن جين (أو جينات) ذات أهمية بطريقة خاضعة للرقابة ومحددة للموضع في الخلايا الجسدية8. بالاقتران مع الأدوات الجزيئية الأخرى ، مثل التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، يمكن الجمع بين طفرات المريض المختلفة لتطوير نماذج ورم دماغ الفئران. تم استخدام هذه الطريقة لأورام الدماغ المختلفة لدى الأطفال ، بما في ذلك الأورام الدبقية وأورام البطانةالعصبية 8 ، بالإضافة إلى نماذج أورام الدماغ للبالغين ، مثل الورم الأرومي الدبقي (GBM).
في حين أن طريقة EP لنمذجة الورم ليست شائعة مثل عملية الزرع ، فإن ما يلي يوضح حتى الآن سهولة نظام النمذجة هذا وقابليته العالية للتكرار. تستخدم الفئران mTmG لإدخال الحمض النووي MADR-plasmid 8,9. يسمح هذا النظام بإعادة تركيب مواقع هدف loxP و Flp recombinase (FRT) الموجودة في موضع Rosa26 للإدخال اللاحق لبلازميد الحمض النووي المانح (أي جين GOF محل الاهتمام)8,9. يوضح البروتوكول التالي استقامة هذه الطريقة بعد الممارسة الدؤوبة ، والقدرة على تطوير نماذج أورام دماغ الفئران بطريقة أصلية ومتسقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في مركز سيدارز سيناء الطبي (IACUC). تم تربية الفئران mTmG متماثلة الزيجوت مع الفئران C57BL / 6J للحصول على فضلات من الفئران mTmG مختلطة الجنس وغير متجانسة الزيجوت لاستخدامها في البروتوكول التالي. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تكهرب الفئران بين أيام ما بعد الولادة 0 و 3 (P0-P3).
1. الإعداد الجراحي
- رش الطاولة الجراحية بمطهر كيميائي (على سبيل المثال ، Vimoba) وامسحه ، متبوعا ب 70٪ من الإيثانول ، وامسحه مرة أخرى.
- ضع الأدوات / المواد التالية على طاولة الجراحة: الماصات الشعرية الزجاجية المسحوبة (انظر المرجع10 حول كيفية سحب الماصات) ، مقص صغير ، حاوية نفايات أدوات حادة بيولوجية صغيرة ، ماصة ميكرولتر وأطراف ماصة ، قطع مربعة 2x من فيلم البارافين ، هلام القطب ، الأقطاب الكهربائية ، حامل الحاقن الدقيق ، ومزيج بلازميد الحمض النووي (انظر جدول المواد والملف التكميلي 1).
- ضع الملحقات التالية على الجهاز على طاولة الجراحة أو على الأرض عند الإشارة إليها: لوحة تحكم الحاقن الدقيق ، والحامل ، والقابس المتصل بالجهاز ، والحامل لتثبيت حامل الحاقن الدقيق على الجانب (مساعد اللحام) ، ودواسة قدم الحاقن الدقيق (على الأرض) ، والأقطاب الكهربائية المتصلة بالماكينة ، ودواسة قدم القطب (على الأرض) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تم وضع دواسة القدم الكهربائية على يمين دواسة قدم الحاقن الدقيق كتذكير بترتيب الاستخدام. - قم بتشغيل الحاقن الدقيق ولوحات التحكم في القطب الكهربائي.
- تحقق من صحة الإعدادات الموجودة على الحاقن الدقيق للتجربة: يجب أن يكون الضغط بين 220-450 هيكتوباسكال ، اعتمادا على كيفية تناول خليط البلازميد.
- تحقق من صحة الإعدادات الموجودة على لوحة القطب للتجربة.
ملاحظة: بالنسبة للتجربة الحالية (ومعظم نماذج أورام المخ لدينا) ، يتم استخدام خمس نبضات من 120 فولت (50 مللي ثانية ؛ مفصولة ب 950 مللي ثانية).
2. التحضير قبل الجراحة
- تحضير مزيج البلازميد في حاقن دقيق.
- استرجع ماصة شعرية زجاجية مسحوبة وأدخلها في حامل الحاقن الدقيق. تأكد من تثبيت الطرف لتثبيته في مكانه.
- امسك حامل الحاقن الدقيق بيد واحدة والمقص الصغير باليد الأخرى ؛ ضع طرف الماصة فوق حاوية صغيرة من المخاطر البيولوجية. مع إغلاق المقص ، اضغط لأسفل برفق على الماصة الشعرية الزجاجية المطولة. قطع حيث ينظر إلى الانحناء ، حوالي 2 مم من الفتحة. إذا بدا القطع ناجحا ، ضعه بعناية على الجانب.
- ضع أنبوب مزيج البلازميد المتاح تجاريا بشكل مسطح على طاولة الجراحة وافتحه. ضع صندوق طرف الماصة أو أي عنصر آخر خلف قاع الأنبوب للحفاظ على ثباته أثناء سحب مزيج البلازميد. ضع الماصة الزجاجية المتصلة بخط الحاقن الدقيق بشكل مسطح على الطاولة وأدخلها برفق في أنبوب مزيج البلازميد ، مع التأكد من أن الطرف موجود جيدا في المزيج بالقرب من قاع الأنبوب.
ملاحظة: بسبب شفط الجاذبية الطبيعية ، سيبدأ شفط مزيج البلازميد في الماصة الزجاجية قبل السحب بنشاط. - باستخدام طرف الماصة الزجاجية في مزيج البلازميد ، استخدم لوحة الحاقن الدقيق لزيادة الكمية التي يتم سحبها. بدءا من 0 ، أدر المقبض الأيمن واطلب في الاتجاه السلبي نحو -60 - سيؤدي ذلك إلى إدخال مزيج البلازميد في الماصة الزجاجية. جلب فقط في ~ 1 بوصة من مزيج البلازميد. أعد المقبض إلى 0 ، ثم قم بإزالة طرف الماصة من المزيج.
ملاحظة: لا تقم بإزالة طرف الماصة من المزيج أثناء وجوده في الاتجاه السلبي ، لأن هذا سيؤدي إلى إطلاق المزيج في الحاقن الدقيق وربما في الأنبوب. - اختبر كمية المزيج في حقنة واحدة عن طريق حقن المزيج على شريط واحد من فيلم البارافين. استخدم دواسة القدم واضغط مرة واحدة لحقن المزيج على فيلم البارافين. استخدم الماصة المحددة على 1 ميكرولتر لامتصاص المزيج على فيلم البارافين لمعرفة ما إذا كان بالضبط 1 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا كان أقل بقليل من 1 ميكرولتر ، يمكن زيادة ضغط الحاقن الدقيق. إذا كان الضغط يقترب من 450 هيكتوباسكال ولا يزال أقل من 1 ميكرولتر ، فإن فتحة الماصة الزجاجية صغيرة جدا وستحتاج إلى قطع أكثر. يقترح وضع مزيج البلازميد مرة أخرى في الأنبوب قبل التشذيب. على الرغم من ذلك ، سيظل هناك مزيج متبقي على المقص ، لذلك من الضروري تنظيف المقص جيدا بعد ذلك باستخدام DNase لإزالة أي مزيج متبقي. إذا كان الحقن أكثر من 1 ميكرولتر ، فستحتاج إلى استخدام ماصة زجاجية مسحوبة جديدة وتقليمها. عندما تكون كمية الاختبار بالضبط 1 ميكرولتر ، يكون طرف الماصة الزجاجي بالحجم الصحيح. - كرر الخطوة 2.1.4 لسحب مزيج بلازميد إضافي للإجراء ، أو حوالي 2-3 بوصات في الماصة الزجاجية المسحوبة. تأكد من أن الخليط لا يذهب بعيدا في الحاقن الدقيق حيث لا يمكن للمرء رؤية النهاية.
ملاحظة: عند الرسم في مزيج البلازميد ، من الضروري تجنب فقاعات الهواء. في حالة وجود فقاعات ، من الضروري إعادة هذه الخطوة عن طريق إزالة مزيج البلازميد من ماصة الزجاج المسحوب والبدء من جديد. ستكون فقاعات الهواء الموجودة ضارة بالخطوات التالية عند الحقن في بطين الجرو. - مع جاهزية مزيج البلازميد في الماصة الزجاجية المسحوبة ، ضع الماصة الجاهزة على الجانب على حامل مساعد اللحام وبعيدا عن الطريق حتى لا تلمسها / تصطدم بها عن طريق الخطأ.
- تحضير للتجربة.
- تحضير دلو الثلج لتخدير الجراء. أضف الماء إلى دلو الثلج ليذوب وساعد على تبريد حامل التخدير (على سبيل المثال ، أعلى صندوق الماصة).
- ضع سطح الصندوق على الثلج المذاب ليبرد.
- قم بإزالة الجراء (الجراء) بعناية من القفص وضعها في أعلى الصندوق المبرد ، والذي يبقى على الجليد. ضع قمة أخرى بشكل غير محكم فوق الجزء السفلي للمساعدة في عملية التبريد.
- بعد 2-3 دقائق ، تحقق من الجراء. افصل الجراء عن بعضها البعض مع البقاء في وضعية الانبطاح.
ملاحظة: سوف تتلوى الجراء ، لكن هذا سيتباطأ مع بدء التخدير البارد. يمكن ترك الجزء العلوي من الصندوق لسهولة عرض الجراء. - للتحقق من التخدير المناسب ، قرصة ذيل الجرو وابحث عن رد فعل. إذا كان هناك رد فعل ، كرر الخطوة 2.2.4. إذا لم يتم إجراء أي صرير أو حركة قليلة ، يكون الجرو جاهزا لهذا الإجراء.
ملاحظة: لا ينبغي أن تبقى الفئران على الجليد لفترات طويلة من الزمن لأن هذا سيؤثر على قدرتها على التعافي بعد العملية. يجب فقط وضع عدد الجراء التي يمكن حقنها وتحويلها بالكهرباء أثناء التخدير على الجليد في وقت واحد ؛ يمكن عمل أعداد أكبر من خلال الخبرة.
3. الحقن المجهري لمزيج بلازميد الحمض النووي في بطين الدماغ
- ضع جروا على الطاولة في الوضع البطني.
- اسحب قليلا على الجزء الخلفي من الرأس لتصور خيوط الجمجمة عبر الجلد. العثور على لامدا على الجمجمة. سيكون موقع البطين / الحقن في منتصف المسافة بين لامدا والعين.
ملاحظة: لامدا هو المكان الذي تتقاطع فيه الغرز السهمية واللامبدية. انظر المرجع11 للتعرف على لامدا على جمجمة الفأر. - اثقب الجلد بطرف الماصة الزجاجي بزاوية عمودية (الماصة مستقيمة نحو السقف). لاحظ مسافة بادئة مقعرة طفيفة عند الضغط على الجمجمة ومقاومة أولية. بمجرد ثقبه وثقب طرف الماصة الزجاجي من خلال المسافة البادئة المقعرة ، يتم الوصول إلى مستوى الحقن المناسب.
- ثبت طرف الماصة الزجاجية في مكانها واضغط على دواسة قدم الحاقن الدقيق مرة واحدة لحقن 1 ميكرولتر من مزيج البلازميد.
ملاحظة: هناك طريقتان لرؤية نجاح الحقن بوضوح. أولا ، اطلب من عضو آخر في المختبر مشاهدة مزيج البلازميد ينخفض في الماصة الزجاجية أثناء حقنه. أيضا ، في حالة استخدام صبغة خضراء سريعة أو صبغة أخرى في مزيج البلازميد ، ستنتشر الصبغة بشكل واضح في البطين تحت الجلد بمجرد حقنها ويمكن رؤيتها بسهولة عند رفعها إلى مصباح جراحي.
4. التثقيب الكهربائي
- ضع قطعة من فيلم البارافين (مربع واحد) على الطاولة واضغط على هلام القطب أعلى الفيلم. قم بتغطية مجاذيف الأقطاب الكهربائية بجل القطب الكهربائي عن طريق تنظيف كمية وفيرة على كل مجداف. يمكن سحب أي هلام زائد يقطر على منشفة ورقية.
ملاحظة: بعد EP الأول ، لا تدع الجل من كل مجداف يلمس الجانب الآخر. سيؤدي ذلك إلى نقل الشحنة ، وعند التقديم على رأس الجرو ، قد يسمع صوت أزيز. سيحدث هذا أيضا إذا لامس الجل الموجود على رأس الجرو من أحد الأقطاب الكهربائية الجل من قطب كهربائي آخر.
تنبيه: يجب توخي الحذر لإبعاد الأصابع عن المجاذيف أثناء التثقيب الكهربائي. - امسك جسم الجرو بيد واحدة (عادة اليد غير المهيمنة) ، مع إبقاء الأصابع خلف الرأس جيدا.
ملاحظة: إذا كان اليد اليمنى ، فمن الأسهل أن تمسك الجرو باليد اليسرى والأقطاب الكهربائية باليد اليمنى. إذا كنت أعسرا ، فافعل العكس. - قرب الأقطاب الكهربائية من رأس الجرو للتأكد من أنها في الموضع المناسب ، مع وجود القطب الموجب على السطح الخارجي للرأس حيث يتم استهداف البطين (على سبيل المثال ، إذا كنت تستهدف البطين الأيسر ، ضع الموجب على الجانب الأيسر للجرو والسالب على الجانب الأيمن للجرو). أثناء وضع الأقطاب الكهربائية ، حرك إصبعك برفق (عادة الإبهام) على الجانب الظهري من الجسم / الرقبة خلف الرأس للمساعدة في رفع الرأس إلى موضعه.
- تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص الذيل والمضي قدما في التثقيب الكهربائي فقط إذا كان الجرو في مستوى التخدير المناسب. اضغط برفق على مجاذيف القطب على الجزء المنقاري من رأس الماوس ، وضعها على العينين. اضغط على دواسة القدم الكهربائية مرة واحدة لبدء التثقيب الكهربائي. يستخدم هذا البروتوكول خمس نبضات 120 فولت (50 مللي ثانية ، مفصولة ب 950 مللي ثانية) ؛ كل نبضة ستكون مسموعة.
- مع كل نبضة ، قم بتدوير مجاذيف القطب قليلا في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة بحيث يتحرك المجداف الموجب نحو أعلى الرأس.
ملاحظة: مع التثقيب الكهربائي المناسب ، سيشعر المرء / يرى ارتعاش جسم جرو الفأر مع كل نبضة.
- مع كل نبضة ، قم بتدوير مجاذيف القطب قليلا في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة بحيث يتحرك المجداف الموجب نحو أعلى الرأس.
- بعد النبض النهائي ، قم بإزالة المجاذيف ووضعها على الجانب. انقل الجرو إلى منشفة ورقية نظيفة واطلب من عضو آخر في المختبر تنظيف الجل من رأس الجرو ووضعه تحت مصباح حراري على "قارب" منشفة ورقية.
ملاحظة: تأكد من أن مصباح الحرارة ليس قريبا جدا من الجراء. تأكد من وجود عضو آخر في المختبر يساعد في هذه الخطوة وراقب الجراء باستمرار. غالبا ما يساعد على حمل الجراء في يد المرء تحت مصباح الحرارة لزيادة الحرارة للجرو. تدليك بلطف البطن من الجرو يمكن أن يساعد أيضا في الشفاء. - أعد الجراء إلى قفص المنزل بمجرد أن يكون لأجسامهم لون وردي صحي ولديهم استجابة صرير لقرصة ذيل خفيفة.
ملاحظة: قبل وضعها مرة أخرى في القفص ، خذ كمية صغيرة من مادة فراش القفص المنزلي ونظف الجراء برفق للحصول على رائحة القفص. ضع الجراء مرة أخرى في القفص تحت مادة الفراش والعودة إلى غرفة الحجز.
5. خطوات ما بعد الجراحة
- أعد مزيج البلازميد غير المستخدم من ماصة زجاج الحاقن الدقيق إلى الأنبوب. إذا كان هناك ما يكفي من الخليط المتبقي ، يمكن استخدامه في الإجراءات المستقبلية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- امسح الجل من المجاذيف الكهربائية باستخدام مناشف ورقية.
- أعد جميع أجزاء المعدات إلى مكانها الأصلي.
ملاحظة: إذا تم استخدام المقص لقطع طرف الماصة الزجاجية بعد تناول مزيج البلازميد ، اترك المقص للتنظيف تماما باستخدام محلول DNase. - رش الطاولة بمطهر كيميائي ، ثم امسحها ، متبوعا برذاذ 70٪ من الإيثانول ، ثم امسحها مرة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام البروتوكول الموصوف أعلاه لتطوير نماذج فأر أورام الدماغ للأطفال والبالغين بنجاح ، مع نشر الأول بتفصيل واسع في Kim et al.8. مع التقنية المناسبة والتخطيط الدقيق لتصميم البلازميد ، يكون نجاح تطوير EP للأورام عادة 100٪. علم الأنسجة هو أسرع وأسهل طريقة للتحقق من نجاح إدخال بلازميد الحمض النووي عند استخدام بروتين المراسل. يتضمن هذا البروتوكول خطوات حول كيفية تطوير نموذج ورم الدماغ GBM مع اختراق 100٪ ، كما أكد التحليل النسيجي. عبر بلازميد متبرع MADR عن كل من بروتين المراسل (smTagBFP2-V5) و SpCas9 (الملف التكميلي 1). كما تم تضمين اثنين من الجين الكابت للورم LOF أحادي التوجيه (sgRNAs) ، موجهان إلى Nf1 و Trp53 (انظر المرجع12 لاستراتيجية استنساخ sgRNA ؛ انظر الملف التكميلي 1 لتسلسل قليل النوكليوتيد المستخدم في هذا البروتوكول). أخيرا ، تمت إضافة بلازميدات Cre و Flp recombinase إلى مزيج البلازميد لإعادة التركيب في موضع Rosa26 (الشكل 1 أ ؛ انظر الملف التكميلي 1). كانت الفئران في حالة احتضار لمدة 5 أشهر بعد EP ، مع اكتشاف نمو كامل للورم من خلال بروتين المراسل والتحليل النسيجي (الشكل 1 ب).
الشكل 1: تلطيخ مناعي لنمو الورم الناجح في 5 أشهر بعد EP . (أ) بلازميد متبرع MADR ل spCas9 وبروتين المراسل TagBFP2-V5. كما تم تضمين مزيج البلازميد في بلازميد Cre-Flp recombinase ، جنبا إلى جنب مع sgRNAs الموجهة إلى Nf1 و Trp53. (ب) عملية إكليلية مأخوذة في 5 أشهر بعد EP لورم GBM مدفوع ب Nf1 و Trp53 LOF. يتم تمييز الخلايا السرطانية ببروتين مراسل TagBFP-V5 المرتبط ب spCas9 (B3). تم الكشف أيضا عن وضع علامات EGFP متفرقة (B2) جنبا إلى جنب مع جميع الخلايا التي لم تعبر عن البلازميدات الموسومة ب tdTomato (B1). شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. الاختصارات: Ctx = القشرة ؛ CC = الجسم الثفني ؛ LV = البطين الجانبي. شارع = المخطط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: تسلسل البلازميد. تسلسلات كاملة لجميع البلازميدات وقليل النيوكليوتيدات المستخدمة في هذا البروتوكول ، بما في ذلك pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE و pCag-FlpO-2A-Cre وقليل النيوكليوتيدات ل sgRNA التي تستهدف Trp53 و Nf1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح توصيل الحمض النووي البلازميد القائم على التثقيب الكهربائي باستخدام البيولوجيا الجزيئية في الجسم الحي ، على غرار تلك المستخدمة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، ولكن مع سرعة وتوطين وكفاءة نقل الفيروس8،13،14. ومع ذلك ، مع هذا الأخير ، تأتي مخاوف السلامة وكذلك الاستجابات المناعية. لقد أظهرنا في نظام النمذجة الخاص بنا باستخدام توصيل EP للحمض النووي البلازميدي أن الحد الأدنى من الاستجابة المناعية يحدث بسبب الإدخال الأولي للماصة الشعرية الزجاجية في بطين الدماغ8. لذلك ، لتحسين أنظمة نمذجة الورم الحالية للعلاج المناعي ، يسمح البروتوكول المقدم أعلاه بنظام نمذجة ما قبل السريرية أكثر ملاءمة وقوة لأورام المخ.
الخطوة الأولى الحاسمة لنمذجة ورم الدماغ الناجحة باستخدام هذه الطريقة هي تصميم البلازميد. على الرغم من عدم وصفه في هذا البروتوكول ، فقد تمت مناقشته على نطاق واسع في Kim et al.8 و Rincon Fernandez Pacheco et al.10 لنماذج أورام المخ لدى الأطفال ، بالإضافة إلى مصادر أخرى للاستخدامات الإضافية15,16. بينما نجح مختبرنا في كهربية ما يصل إلى ستة بلازميدات ، سيكون هناك حد أعلى لمقدار الحمض النووي الذي يمكن توصيله. هذا الحد الأعلى مقيد بتركيز الحمض النووي للبلازميد ، وأحجام البلازميد ، والجهد ، وحجم الحمض النووي الذي يتم تسليمه ، والذي يقتصر في حد ذاته على حجم البطين الدماغي في سن التثقيب الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، مع وجود بلازميدات الحمض النووي المتعددة في المزيج ، من الضروري أن يكون لديك مزيج بلازميد معلق جيدا قبل الحقن. إذا لم يتم إعادة تعليق المزيج جيدا ، فسيكون من الصعب تناوله في ماصة شعرية زجاجية ضيقة. أيضا ، مع مزيج البلازميد المناسب ، تسمح إضافة صبغة خضراء سريعة (10٪ v / v) برؤية واضحة لمزيج البلازميد الذي يتم تناوله في بطين الدماغ أثناء الإعطاء (الخطوة 3.4). ومع ذلك ، فإن أحد التحذيرات المهمة لهذا هو أن الصبغة يمكن أن تتداخل مع تلطيخ الأجسام المضادة في الأطوال الموجية الحمراء البعيدة (على سبيل المثال ، Cy5) للأنسجة التي تتم معالجتها في غضون عدة أسابيع بعد EP8. على الرغم من أن الصبغة الخضراء السريعة مفيدة جدا عند تعلم EP لأول مرة ، إلا أنه يمكن التخلص منها لتجنب تلطيخ إيجابي كاذب. تجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة للخطوة 3.4 ، لن يكون توصيل مزيج البلازميد في البطين مرئيا ، لذلك سيكون من الضروري مشاهدة الماصة الزجاجية حتى ينخفض الحجم أثناء حقنه.
من أجل الاتساق والتعامل السليم مع الحقن ، هناك عدة عوامل يجب وضعها في الاعتبار: 1) حجم الحقن. على الرغم من أن الأمر قد يستغرق عدة محاولات لقطع الماصة الشعرية الزجاجية بدقة (الخطوة 2.1.2) ، فمن الأهمية بمكان أن يتم حقن 1 ميكرولتر فقط من مزيج البلازميد لكل. الزيادة أو النقصان في الحجم بين سيؤثر بالتأكيد على زمن تكوين الورم. 2) بمجرد ضبط حجم الحقن ، يجب عدم تغيير معلمات الحاقن الدقيق ، لأن ذلك سيؤثر على الحجم. 3) بمجرد إحضار مزيج البلازميد في الماصة الشعرية الزجاجية ، يجب إبعاد الماصة عن الطريق حتى لا تضغط على نفسه أو الآخرين عن طريق الخطأ. يعد استخدام حامل الماصة الدقيقة (مساعد اللحام ؛ انظر جدول المواد) الذي يتم تثبيته على حامل الحاقن الدقيق مفيدا لهذا الغرض. ومع ذلك ، إذا لم يتم حقن مزيج البلازميد بعد فترة وجيزة ، فمن المحتمل أن يسد الطرف. لذلك ، من المهم إجراء اختبار واحد للحقن المجهري على قطعة من البارافيلم مباشرة قبل الحقن في بطين الدماغ للتأكد من عدم وجود انسداد يسد الفتحة. أخيرا ، على غرار أي تقنية جراحية أخرى ، يختلف تنفيذ البروتوكول لكل فرد. لذلك ، من الضروري أن يكون لديك نفس الفني الذي يقوم بالحقن المجهري و / أو EP لجميع مجموعات الفئران في التجربة.
ركزت نماذج أورام المخ التي تم تطويرها في مختبرنا على الأورام الدبقية. من منظور بيولوجي عصبي ، فإن تنفيذ هذه الطريقة بين أيام ما بعد الولادة 0-3 يستهدف فترة التكوين الدبقي وفترة تكوين الخلايا العصبية بعد الجنين. قد يتطلب الاهتمام بأورام الدماغ البديلة تعديلا في النقطة الزمنية و / أو موضع الأقطاب الكهربائية. تتوفر العديد من البروتوكولات في الرحم EP والتي ستكون ذات صلة بالأورام العصبية15،17،18.
هناك بعض القيود على هذه الطريقة. إن القدرة على استنساخ وخلط ومطابقة كل من بلازميدات الحمض النووي LOF و GOF باستخدام CRISPR ، والترانسبوزونات ، ومؤخرا ، نظام MADR يسمح بنمذجة مجموعات لا حصر لها من طفرات المريض. تقنيات الحقن المجهري و EP بسيطة نسبيا ، على الرغم من أنها تتطلب بعض محاولات الممارسة للتحسين وتصبح متسقة. أحد قيود النموذج المقدم هو طول الوقت الذي يستغرقه ورم GBM ليتطور بشكل كامل (5 أشهر). على الرغم من ذلك ، نحن نعمل حاليا على نماذج إضافية باستخدام طفرات ورم المريض الشائعة التي تؤدي إلى نمو الورم العدواني الذي يستمر أقل من 2 أشهر. بالإضافة إلى القيود ، فإن المعدات نفسها هي استثمار أولي كبير (حوالي 20,000 دولار - 30,000 دولار) ؛ ومع ذلك ، فإن القدرة على إلكتروب عشرات إن لم يكن مئات الفئران في جلسة واحدة تسمح بقوة لا تصدق لتجربة ما قبل السريرية. مع ما يقال ، إذا كانت هناك مشكلات في تربية الفئران ، فقد يصبح هذا أكبر قيد ، حيث من الضروري أن يكون لديك مربين أصحاء وفضلات صحية.
لقد مرت عدة عقود منذ حدوث تقدم في علاجات أورام المخ ، مع آخر أكبر تحسن في العلاج الكيميائي Temozolomide الذي مدد البقاء على قيد الحياة لبضعة أشهر فقط19. أحدث العلاج المناعي ثورة في العديد من أنواع السرطان المختلفة ، لكنه لم يحدث بعد تأثيرا كبيرا على مستوى الرعاية في علم الأورام العصبية. ومن المثير للاهتمام ، أن نماذج أورام دماغ الفئران المستخدمة حاليا أظهرت نجاحا كبيرا في العلاج المناعي ، لكنها تفشل باستمرار في الترجمة إلى العيادة وإظهار النجاح مع المرضى. لذلك من الضروري التراجع خطوة إلى الوراء وإعادة تقييم نماذج ورم الفئران المستخدمة. تعتمد النماذج الحالية على استخدام خطوط الخلايا القديمة ذات الطفرات المحدودة التي لا توجد عادة في المرضى أثناء حقن آلاف الخلايا في الدماغ. باستخدام التقنية التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ، يتم تلخيص ملفات تعريف طفرة ورم المريض المختلفة في نموذج الفأر ، مما يسمح بتطور تدريجي أصلي للأورام في إطار زمني يسمح بإجراء اختبار ما قبل السريري في الفئران ذات الكفاءة المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر Gi Bum Kim على التلوين المناعي والصور. كما نشكر إميلي هاتاناكا ونعومي كوبريتز وبول لينيش على النصائح المفيدة بشأن البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
