Summary
Het gebruik van een immunocompetent, autochtoon tumormodel aangedreven door gemeenschappelijke patiëntmutaties voor preklinische tests is van cruciaal belang voor immunotherapeutische tests. Dit protocol beschrijft een methode om muismodellen voor hersentumoren te genereren met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA die veelvoorkomende patiëntmutaties vertegenwoordigen, waardoor een nauwkeurig, reproduceerbaar en consistent muismodel wordt verkregen.
Abstract
Tumormodellen zijn van cruciaal belang voor het preklinisch testen van hersentumoren in termen van het verkennen van nieuwe, effectievere behandelingen. Met een aanzienlijke interesse in immunotherapie is het nog belangrijker om een consistent, klinisch relevant, immunocompetent muismodel te hebben om de tumor- en immuuncelpopulaties in de hersenen en hun reactie op de behandeling te onderzoeken. Hoewel de meeste preklinische modellen gebruik maken van orthotope transplantatie van gevestigde tumorcellijnen, maakt het hier gepresenteerde modelleringssysteem een "gepersonaliseerde" weergave mogelijk van patiëntspecifieke tumormutaties in een geleidelijke, maar effectieve ontwikkeling van DNA-constructen die in vivo in delende neurale voorlopercellen (NPC's) zijn ingebracht. DNA-constructen bevatten de mozaïekanalyse met de dual-recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling (MADR)-methode, waardoor somatische mutagenese van drivermutaties in één kopie mogelijk is. Met behulp van pasgeboren muizenpups tussen de geboorte en 3 dagen oud, worden NPC's aangevallen door gebruik te maken van deze delende cellen die de laterale ventrikels bekleden. Micro-injectie van DNA-plasmiden (bijv. MADR-afgeleid, transposons, CRISPR-gericht sgRNA) in de ventrikels wordt gevolgd door elektroporatie met behulp van peddels die het rostrale gebied van het hoofd omringen. Bij elektrische stimulatie wordt het DNA opgenomen in de delende cellen, met het potentieel om te integreren in het genoom. Het gebruik van deze methode is met succes aangetoond bij het ontwikkelen van zowel pediatrische als volwassen hersentumoren, waaronder de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor, glioblastoom. Dit artikel bespreekt en demonstreert de verschillende stappen van het ontwikkelen van een hersentumormodel met behulp van deze techniek, inclusief de procedure van het verdoven van jonge muizenpups, tot micro-injectie van het plasmidemengsel, gevolgd door elektroporatie. Met dit autochtone, immunocompetente muismodel zullen onderzoekers de mogelijkheid hebben om preklinische modelleringsbenaderingen uit te breiden, in een poging om de effectieve behandeling van kanker te verbeteren en te onderzoeken.
Introduction
Hersentumormodellen bij muizen zijn cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen van de vorming en behandeling van hersentumoren. De huidige modellen omvatten doorgaans snel geproduceerde subcutane of orthotope transplantaties van veelgebruikte tumorcellijnen, gebaseerd op een beperkt aantal drivermutaties of van patiënten afgeleide xenotransplantaatmodellen, met behulp van immunodeficiënte muizen die goede immunotherapiestudies belemmeren 1,2,3,4. Bovendien kunnen deze preklinische resultaten leiden tot valse positieven, in die zin dat dergelijke modellen dramatische, vaak curatieve effecten kunnen vertonen als reactie op therapie, maar dit vertaalt zich niet naar de kliniek 2,5,6,7. Het vermogen om snel genetisch gemanipuleerde preklinische muismodellen te produceren die meer een afspiegeling zijn van de handtekeningen van patiëntmutaties is absoluut noodzakelijk voor het verbeteren van de validiteit van preklinische resultaten.
Op elektroporatie (EP) gebaseerde toediening van DNA-plasmiden om zowel mutaties met functieverlies (LOF) als functiewinst (GOF) te induceren, maakt het mogelijk dergelijke modellen te genereren. We ontwikkelden een methode voor een nog preciezere weergave van GOF-drivermutaties, genaamd mozaïekanalyse met dual-recombinase-gemedieerde cassette-uitwisseling, of MADR8. Deze methode maakt het mogelijk om een gen (of genen) van belang op een gecontroleerde, locusspecifieke manier tot expressie te brengen in somatische cellen8. In combinatie met andere moleculaire hulpmiddelen, zoals geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen (CRISPR), kunnen verschillende patiëntmutaties worden gecombineerd om hersentumormodellen van muizen te ontwikkelen. Deze methode is gebruikt voor verschillende pediatrische hersentumoren, waaronder gliomen en ependymomen8, evenals volwassen hersentumormodellen, zoals glioblastoom (GBM).
Hoewel de EP-methode van tumormodellering niet zo gebruikelijk is als een transplantatie, toont het volgende tot nu toe het gemak en de hoge reproduceerbaarheid van dit modelleringssysteem aan. mTmG-muizen worden gebruikt voor het inbrengen van het MADR-plasmide-DNA 8,9. Dit systeem maakt de recombinatie mogelijk van loxP- en Flp-recombinasedoelwitten (FRT)-locaties op de Rosa26-locus voor daaropvolgende insertie van het donor-DNA-plasmide (d.w.z. het GOF-gen van belang)8,9. Het volgende protocol demonstreert de rechtlijnigheid van deze methode na ijverige oefening en het vermogen om hersentumormodellen van muizen op een autochtone, consistente manier te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door het Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Homozygote mTmG-muizen werden gekruist met C57BL/6J-muizen om nesten van heterozygote mTmG-muizen van gemengd geslacht te verkrijgen voor gebruik in het volgende protocol. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Muizenpups werden geëlektropoleerd tussen postnatale dag 0 en 3 (P0-P3).
1. Chirurgische opstelling
- Spuit de operatietafel in met een chemisch ontsmettingsmiddel (bijv. Vimoba) en veeg het af, gevolgd door 70% ethanol, en veeg het opnieuw af.
- Plaats de volgende instrumenten/materialen op de operatietafel: capillaire pipetten van getrokken glas (zie referentie10 voor het trekken van pipetten), een kleine schaar, een kleine container voor biologisch gevaarlijk afval van scherpe voorwerpen, een pipetter en pipetpunten van microliter, 2x gesneden vierkante stukken paraffinefilm, elektrodegel, elektroden, houder voor de microinjector en DNA-plasmidemix (zie Materiaaltabel en aanvullend dossier 1).
- Plaats de volgende hulpstukken op de apparatuur op de operatietafel of op de vloer wanneer dit wordt aangegeven: bedieningspaneel van de microinjector, houder en stekker bevestigd aan de machine, standaard om de microinjectorhouder opzij te houden (soldeerhulp), voetpedaal microinjector (op de vloer), elektroden bevestigd aan de machine en elektrodevoetpedaal (op de vloer) (zie Materiaaltabel).
NOTITIE: Het voetpedaal van de elektrode is rechts van het voetpedaal van de microinjector geplaatst als herinnering aan de volgorde van gebruik. - Schakel de bedieningspanelen van de microinjector en de elektrode in.
- Controleer of de instellingen op de microinjector correct zijn voor het experiment: de druk moet tussen 220-450 hPa liggen, afhankelijk van hoe het plasmidemengsel wordt opgenomen.
- Controleer of de instellingen op het elektrodepaneel correct zijn voor het experiment.
OPMERKING: Voor het huidige experiment (en de meeste van onze hersentumormodellen) worden vijf pulsen van 120 V (50 ms; gescheiden door 950 ms) gebruikt.
2. Pre-operatieve voorbereiding
- Bereid het plasmidemengsel in de micro-injector.
- Pak een capillaire pipet van getrokken glas en plaats deze in de microinjectorhouder. Zorg ervoor dat de punt is vastgeschroefd om op zijn plaats te blijven.
- Houd de microinjectorhouder in de ene hand en de kleine schaar in de andere; Houd de punt van de pipet boven een kleine container voor biologisch gevaarlijk scherpe voorwerpen. Druk met gesloten schaar lichtjes op de verlengde glazen capillaire pipet. Snijd waar de bocht te zien is, ongeveer 2 mm van de opening. Als de snede er succesvol uitziet, plaatst u deze voorzichtig opzij.
- Plaats de in de handel verkrijgbare plasmide-mixbuis plat op de operatietafel en open deze. Houd het pipetpuntdoosje of een ander voorwerp achter de bodem van het buisje om het stabiel te houden tijdens het opzuigen van het plasmidemengsel. Plaats de glazen pipet die aan de micro-injectorleiding is bevestigd plat op tafel en steek deze voorzichtig in de buis van het plasmidemengsel, waarbij u ervoor zorgt dat de punt goed in het mengsel zit in de buurt van de bodem van de buis.
OPMERKING: Vanwege de natuurlijke zwaartekrachtzuiging begint het opzuigen van het plasmidemengsel in de glazen pipet voordat het actief wordt aangezogen. - Met de punt van de glazen pipet in het plasmidemengsel, gebruikt u het micro-injectorpaneel om de hoeveelheid die wordt aangezogen te vergroten. Begin bij 0, draai de rechterknop en draai in de negatieve richting naar -60 - hierdoor wordt het plasmidemengsel in de glazen pipet gebracht. Breng slechts ~ 1 inch plasmidemix binnen. Draai de knop terug naar 0 en haal de pipetpunt uit het mengsel.
OPMERKING: Verwijder de pipetpunt niet uit het mengsel terwijl u in negatieve richting bent, omdat het mengsel dan in de microinjector en mogelijk in de slang wordt geschoten. - Test de hoeveelheid mengsel in één injectie door het mengsel op één strook paraffinefilm te injecteren. Gebruik het voetpedaal en druk één keer om het mengsel op de paraffinefilm te injecteren. Gebruik de pipettor ingesteld op 1 μL om het mengsel op de paraffinefilm op te nemen om te zien of het precies 1 μL is.
NOTITIE: Als het iets minder is dan 1 μL, kan de druk van de microinjector worden verhoogd. Als de druk 450 hPa nadert en nog steeds minder dan 1 μL is, is de opening van de glazen pipet te klein en moet deze meer worden bijgesneden. Het wordt aanbevolen om het plasmidemengsel terug in de buis te plaatsen voordat u gaat trimmen. Desondanks zal er nog steeds een restmengsel op de schaar achterblijven, dus het is absoluut noodzakelijk om de schaar daarna grondig schoon te maken met DNase om eventuele resterende mix te verwijderen. Als de injectie meer dan 1 μL bedraagt, moet een nieuwe getrokken glazen pipet worden gebruikt en bijgesneden. Wanneer de testhoeveelheid precies 1 μL is, heeft de glazen pipetpunt de juiste maat. - Herhaal stap 2.1.4 om extra plasmidemix op te zuigen voor de procedure, of ongeveer 2-3 inch in de getrokken glazen pipet. Zorg ervoor dat het mengsel niet te ver in de micro-injector terechtkomt waar men het einde niet kan zien.
NOTITIE: Bij het opzuigen van het plasmidemengsel is het van cruciaal belang om luchtbellen te vermijden. Als er luchtbellen aanwezig zijn, is het noodzakelijk om deze stap opnieuw uit te voeren door het plasmidemengsel uit de getrokken glazen pipet te verwijderen en opnieuw te beginnen. De aanwezige luchtbellen zijn nadelig voor de volgende stappen bij het injecteren in de hartkamer van de pup. - Met het plasmidemengsel klaar in de getrokken glazen pipet, plaatst u de klaargemaakte pipet opzij op de soldeerhulpstandaard en uit de weg om deze niet per ongeluk aan te raken/stoten.
- Bereid de dieren voor op het experiment.
- Zet een ijsemmer klaar voor het verdoven van pups. Voeg water toe aan de ijsemmer om te smelten en help de verdovingshouder af te koelen (bijv. de bovenkant van de pipetdoos).
- Plaats de bovenkant van de doos op het gesmolten ijs om af te koelen.
- Haal de pup(pen) voorzichtig uit de kooi en plaats ze in de afgekoelde bovenkant van de doos, die op het ijs blijft liggen. Plaats een andere bovenkant losjes over de bodem om het koelproces te bevorderen.
- Controleer na 2-3 minuten de pups. Scheid de pups van elkaar terwijl ze in buikligging blijven.
OPMERKING: De pups zullen kronkelen, maar dit zal vertragen als de koude verdoving begint. De bovenkant van de doos kan worden weggelaten zodat de pups gemakkelijk kunnen worden bekeken. - Om te controleren of de pup goed verdoofd is, knijpt u in de staart van de pup en zoekt u naar een reactie. Als er een reactie optreedt, herhaal dan stap 2.2.4. Als er geen piep of weinig beweging wordt gemaakt, is de pup klaar voor de ingreep.
OPMERKING: Muizen mogen niet voor langere tijd op ijs worden gehouden, omdat dit hun vermogen om te herstellen na de procedure zal beïnvloeden. Alleen het aantal pups dat zowel kan worden geïnjecteerd als geëlektropoleerd terwijl ze nog onder narcose zijn, moet tegelijk op ijs worden gelegd; Grotere aantallen kunnen worden gedaan met ervaring.
3. Micro-injectie van DNA-plasmidemengsel in het hersenventrikel
- Leg een pup op de tafel in de buikligging.
- Trek de achterkant van het hoofd iets naar achteren om de schedelhechtingen door de huid te visualiseren. Zoek lambda op de schedel. De ventrikel/injectieplaats bevindt zich halverwege tussen lambda en het oog.
OPMERKING: Lambda is waar de sagittale en lambdoïde hechtingen elkaar kruisen. Zie referentie11 voor de identificatie van lambda op de muizenschedel. - Prik met de punt van de glazen pipet in de huid in een loodrechte hoek (de pipet staat recht omhoog naar het plafond). Let op een lichte holle inkeping bij het drukken op de schedel en een aanvankelijke weerstand. Zodra de glazen pipetpunt is doorboord en door de holle inkeping steekt, wordt het juiste injectieniveau bereikt.
- Houd de punt van de glazen pipet op zijn plaats en druk eenmaal op het voetpedaal van de microinjector om 1 μL van het plasmidemengsel te injecteren.
OPMERKING: Er zijn twee manieren om duidelijk te zien dat de injectie succesvol was. Laat eerst een ander laboratoriumlid kijken hoe het plasmidemengsel in de glazen pipet terechtkomt terwijl het wordt geïnjecteerd. Ook als u snel groen of een andere kleurstof in de plasmidemix gebruikt, zal de kleurstof zich zichtbaar verspreiden in het ventrikel onder de huid zodra deze is geïnjecteerd en is deze gemakkelijk zichtbaar wanneer deze tegen een chirurgische lamp wordt gehouden.
4. Elektroporatie
- Leg een stuk paraffinefolie (één vierkant) op tafel en knijp de elektrodegel bovenop de film eruit. Bedek de elektrodepeddels met elektrodegel door een royale hoeveelheid op elke peddel te borstelen. Overtollige gel die eraf druipt, kan op keukenpapier worden afgeveegd.
OPMERKING: Laat na de eerste EP de gel van elke peddel de andere kant niet raken. Hierdoor wordt de lading overgedragen en bij het aanbrengen op het hoofd van de pup kan een sissend geluid worden gehoord. Dit gebeurt ook als de gel op het hoofd van de pup van de ene elektrode in contact komt met de gel van een andere.
LET OP: Zorg ervoor dat de vingers tijdens de elektroporatie uit de buurt van de peddels worden gehouden. - Houd het lichaam van de pup in één hand (meestal de niet-dominante hand) en houd de vingers goed achter het hoofd.
NOTITIE: Als u rechtshandig bent, is het het gemakkelijkst om de pup met de linkerhand vast te houden en de elektroden met de rechterhand. Als je linkshandig bent, doe dan het tegenovergestelde. - Breng de elektroden dicht bij het hoofd van de pup om ervoor te zorgen dat ze zich in de juiste positie bevinden, met de positieve elektrode aan de buitenkant van het hoofd waar het ventrikel wordt aangevallen (bijv. als u zich op de linkerventrikel richt, plaatst u de positieve aan de linkerkant van de pup en de negatieve aan de rechterkant van de pup). Terwijl u de elektroden plaatst, schuift u voorzichtig een vinger (meestal de duim) aan de dorsale zijde van het lichaam/nek achter het hoofd om het hoofd in positie te brengen.
- Controleer de diepte van de anesthesie door in de staart te knijpen en ga alleen verder met elektroporatie als de pup zich in het juiste anesthesievlak bevindt. Knijp lichtjes in de elektrodepeddels op het rostrale deel van het muizenhoofd en plaats ze over de ogen. Druk eenmaal op het voetpedaal van de elektrode om de elektroporatie te starten. Dit protocol maakt gebruik van vijf pulsen van 120 V (50 ms, gescheiden door 950 ms); Elke puls is hoorbaar.
- Draai bij elke puls de elektrodepeddels iets tegen de klok in, zodat de positieve peddel naar de bovenkant van het hoofd beweegt.
OPMERKING: Met de juiste elektroporatie zal men het lichaam van de muispup voelen/zien trillen bij elke puls.
- Draai bij elke puls de elektrodepeddels iets tegen de klok in, zodat de positieve peddel naar de bovenkant van het hoofd beweegt.
- Verwijder na de laatste puls de peddels en leg ze opzij. Verplaats de pup naar een schone papieren handdoek en laat een ander laboratoriumlid de gel van het hoofd van de pup verwijderen en onder een warmtelamp op een papieren handdoek "boot" plaatsen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de warmtelamp niet te dicht bij de pups staat. Zorg ervoor dat een ander lablid helpt bij deze stap en houd de pups constant in de gaten. Het helpt vaak om de pups in de hand te houden onder de warmtelamp om de warmte voor de pup te verhogen. Het zachtjes masseren van de buik van de pup kan ook helpen bij het herstel. - Breng de pups terug naar de thuiskooi zodra hun lichaam een gezonde roze kleur heeft en een piepende reactie heeft op een lichte staartknijp.
NOTITIE: Voordat u ze terug in de kooi plaatst, neemt u een kleine hoeveelheid van het bodembedekkingsmateriaal van de thuiskooi en borstelt u de pups er lichtjes mee voor de kooigeur. Plaats de pups terug in de kooi onder het strooisel en keer terug naar de wachtruimte.
5. Postoperatieve stappen
- Doe het ongebruikte plasmidemengsel uit de glazen pipet van de microinjector terug naar het buisje. Als er nog voldoende mengsel over is, kan dit in toekomstige procedures worden gebruikt. Bewaren bij -20 °C.
- Veeg de gel van de elektrodepeddels met keukenpapier.
- Zet alle onderdelen van de apparatuur terug op hun oorspronkelijke plaats.
NOTITIE: Als er een schaar is gebruikt om de punt van de glazen pipet af te knippen nadat het plasmidemengsel is opgenomen, laat de schaar dan buiten om grondig schoon te maken met DNase-oplossing. - Spuit de tafel in met een chemisch ontsmettingsmiddel, veeg het af, gevolgd door een spray van 70% ethanol en veeg het vervolgens weer af.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierboven beschreven protocol is gebruikt om met succes zowel pediatrische als volwassen hersentumormuismodellen te ontwikkelen, waarbij de eerste in uitgebreid detail is gepubliceerd in Kim et al.8. Met de juiste techniek en zorgvuldige planning van het plasmide-ontwerp is het succes voor EP-ontwikkeling van tumoren doorgaans 100%. Histologie is de snelste en gemakkelijkste manier om te controleren op succesvolle DNA-plasmide-insertie wanneer een reporter-eiwit wordt gebruikt. Dit protocol omvat stappen voor het ontwikkelen van een GBM-hersentumormodel met 100% penetrantie, zoals bevestigd door histologische analyse. Een MADR-donorplasmide bracht zowel een reportereiwit (smTagBFP2-V5) als SpCas9 (aanvullend dossier 1) tot expressie. Twee sterke driver LOF tumorsuppressorgen single-guide RNA's (sgRNA's) werden ook geïncludeerd, gericht op Nf1 en Trp53 (zie referentie12 voor sgRNA-kloonstrategie; zie aanvullend bestand 1 voor oligonucleotidesequenties die in dit protocol worden gebruikt). Ten slotte werden de Cre- en Flp-recombinaseplasmiden toegevoegd aan het plasmidenmengsel voor recombinatie op de Rosa26-locus (Figuur 1A; zie aanvullend dossier 1). Muizen waren 5 maanden na EP stervende en volledige tumorgroei werd gedetecteerd via het reportereiwit en histologische analyse (Figuur 1B).
Figuur 1: Immunofluorescerende kleuring van succesvolle tumorgroei 5 maanden na EP . (A) MADR-donorplasmide voor spCas9 en het reportereiwit TagBFP2-V5. Ook opgenomen in de plasmidemix was een Cre-Flp-recombinaseplasmide, samen met sgRNA's gericht op Nf1 en Trp53. (B) Een coronale sectie genomen 5 maanden na EP van een GBM-tumor aangedreven door Nf1 en Trp53 LOF. Tumorcellen zijn gelabeld met het TagBFP-V5-reportereiwit gekoppeld aan spCas9 (B3). Schaarse EGFP-labeling wordt ook gedetecteerd (B2) samen met alle cellen die de plasmiden die zijn gelabeld met tdTomato (B1) niet tot expressie brachten. Schaalbalk = 1.000 μm. Afkortingen: Ctx = cortex; CC = corpus callosum; LV = laterale ventrikel; Str = striatum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Plasmide-sequenties. Volledige sequenties van alle plasmiden en oligonucleotiden die in dit protocol worden gebruikt, inclusief pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre en de oligonucleotiden voor sgRNA gericht op Trp53 en Nf1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA maakt het in vivo gebruik van moleculaire biologie mogelijk, vergelijkbaar met die gebruikt in genetisch gemanipuleerde muismodellen, maar met de snelheid, lokalisatie en efficiëntie van virale transductie 8,13,14. Met dit laatste komen echter zowel veiligheidsproblemen als immuunreacties. We hebben in ons modelleringssysteem met behulp van EP-afgifte van plasmide-DNA aangetoond dat er een minimale immuunrespons optreedt als gevolg van de eerste inbrenging van de glazen capillaire pipet in het hersenventrikel8. Daarom, om de huidige tumormodelleringssystemen voor immunotherapie te verbeteren, maakt het hierboven gepresenteerde protocol een doelmatiger en robuuster preklinisch modelleringssysteem voor hersentumoren mogelijk.
De eerste cruciale stap voor succesvolle modellering van hersentumoren met behulp van deze methode is plasmideontwerp. Hoewel het niet in dit protocol wordt beschreven, is het uitgebreid besproken in Kim et al.8 en Rincon Fernandez Pacheco et al.10 voor pediatrische hersentumormodellen, evenals andere bronnen voor aanvullend gebruik15,16. Hoewel ons laboratorium met succes tot zes plasmiden heeft geëlektropoleerd, zal er een bovengrens zijn aan de hoeveelheid DNA die kan worden afgeleverd. Deze bovengrens wordt beperkt door de plasmide-DNA-concentratie, de plasmidegrootte, de spanning en het volume van het afgeleverde DNA, dat zelf wordt beperkt door de grootte van het hersenventrikel op de leeftijd van elektroporatie. Bovendien is het, met meerdere DNA-plasmiden in de mix, absoluut noodzakelijk om voorafgaand aan de injectie een goed gesuspendeerde plasmidemix te hebben. Als het mengsel niet goed wordt geresuspendeerd, zal het moeilijk zijn om het op te nemen in de smalle glazen capillaire pipet. Met de juiste plasmidemix zorgt de toevoeging van snelle groene kleurstof (10% v/v) ook voor een duidelijk zicht op de plasmidemix die tijdens toediening in het hersenventrikel is opgenomen (stap 3.4). Een belangrijk voorbehoud hierbij is echter dat de kleurstof kan interfereren met antilichaamkleuring in de verrode golflengten (bijv. Cy5) van weefsel dat binnen enkele weken na EP8 is verwerkt. Hoewel de snelle groene kleurstof erg nuttig is bij het leren van EP, kan deze worden geëlimineerd om vals-positieve kleuring te voorkomen. Het is de moeite waard om in gedachten te houden dat voor stap 3.4 de afgifte van het plasmidemengsel in het ventrikel niet zichtbaar zal zijn, dus het is van cruciaal belang om de glazen pipet in de gaten te houden om het volume te verminderen terwijl deze wordt geïnjecteerd.
Voor consistentie en een juiste behandeling van injecties zijn er verschillende factoren waarmee rekening moet worden gehouden: 1) het injectievolume. Hoewel het meerdere pogingen kan vergen om de glazen capillaire pipet nauwkeurig te snijden (stap 2.1.2), is het van cruciaal belang dat voor elk dier slechts 1 μL plasmidemengsel wordt geïnjecteerd. Stijgingen of dalingen van het volume tussen dieren zullen zeker de latentie van tumorvorming beïnvloeden. 2) Zodra het injectievolume is ingesteld, mogen de parameters van de microinjector niet worden gewijzigd, omdat dit het volume zal beïnvloeden. 3) Zodra het plasmidemengsel in de glazen capillaire pipet naar boven is gebracht, moet de pipet uit de weg worden gehouden om niet per ongeluk zichzelf of anderen te prikken. Hiervoor is het handig om een micropipetstandaard (soldeerhulp; zie Materiaaltabel) te gebruiken die op de microinjectorhouder wordt geklikt. Als het plasmidemengsel echter niet kort daarna wordt geïnjecteerd, zal het waarschijnlijk de punt verstoppen. Daarom is het belangrijk om één micro-injectietest uit te voeren op een stuk parafilm vlak voordat het in het hersenventrikel wordt geïnjecteerd om er zeker van te zijn dat er geen verstopping is die de opening blokkeert. Ten slotte is, net als bij elke andere chirurgische techniek, de uitvoering van het protocol voor elk individu anders. Het is daarom absoluut noodzakelijk om dezelfde technicus de micro-injectie en/of EP te laten uitvoeren voor alle groepen muizen in een experiment.
De hersentumormodellen die in ons lab zijn ontwikkeld, hebben zich gericht op gliomen. Vanuit een neurobiologisch perspectief richt het uitvoeren van deze methode tussen postnatale dagen 0-3 zich op de gliogeneseperiode en de periode na embryonale neurogenese. Interesse in alternatieve hersentumoren kan een aanpassing van het tijdstip en/of de positie van elektroden vereisen. Er zijn verschillende protocollen beschikbaar voor EP in utero die relevant zouden zijn voor neurale tumoren15,17,18.
Er zijn een paar beperkingen aan deze methode. De mogelijkheid om zowel LOF- als GOF-DNA-plasmiden te klonen en te mixen en matchen met behulp van CRISPR, transposons en, meer recentelijk, het MADR-systeem, maakt het mogelijk om eindeloze combinaties van patiëntmutaties te modelleren. De technieken van micro-injectie en EP zijn relatief eenvoudig, hoewel ze een paar oefenpogingen vergen om te verbeteren en consistent te worden. Een beperking van het gepresenteerde model is de tijd die nodig is om de GBM-tumor volledig te ontwikkelen (5 maanden). Desondanks werken we momenteel aan aanvullende modellen met behulp van veel voorkomende tumormutaties bij patiënten die leiden tot agressieve tumorgroei die minder dan 2 maanden duurt. Naast beperkingen is de apparatuur zelf een substantiële initiële investering (ongeveer $ 20.000 - $ 30.000); Het vermogen om tientallen, zo niet honderden muizen in één keer te elektropoleren, zorgt echter voor een ongelooflijke kracht voor een preklinisch experiment. Dat gezegd hebbende, als er problemen zijn met het fokken van muizen, kan dit de grootste beperking worden, omdat het absoluut noodzakelijk is om gezonde fokkers en gezonde nesten te hebben.
Het is al tientallen jaren geleden dat er vooruitgang is geboekt in de behandeling van hersentumoren, met de laatste grootste verbetering van het chemotherapeuticum Temozolomide die de overleving met slechts enkele maanden verlengt. Immunotherapie heeft een revolutie teweeggebracht in veel verschillende vormen van kanker, maar moet nog een significante impact hebben op de zorgstandaard in de neuro-oncologie. Interessant is dat de momenteel gebruikte hersentumormodellen van muizen veel succes hebben laten zien met immunotherapie, maar er voortdurend niet in slagen zich te vertalen naar de kliniek en succes te laten zien bij patiënten. Het is daarom absoluut noodzakelijk om een stap terug te doen en de gebruikte muistumormodellen opnieuw te evalueren. De huidige modellen zijn afhankelijk van het gebruik van oudere cellijnen met beperkte mutaties die niet vaak worden aangetroffen bij patiënten, terwijl duizenden cellen in de hersenen worden geïnjecteerd. Met de techniek die in dit protocol wordt besproken, worden verschillende tumormutatieprofielen van patiënten in een muismodel gerecapituleerd, waardoor een autochtone, geleidelijke ontwikkeling van tumoren mogelijk wordt binnen een tijdsbestek dat preklinische tests bij immunocompetente muizen mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Gi Bum Kim voor de immunofluorescerende kleuring en afbeeldingen. We danken ook Emily Hatanaka, Naomi Kobritz en Paul Linesch voor nuttig advies over het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
