Summary
L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.
Abstract
I modelli tumorali sono fondamentali per i test preclinici dei tumori cerebrali in termini di esplorazione di nuovi trattamenti più efficaci. Con un interesse significativo per l'immunoterapia, è ancora più importante disporre di un modello murino coerente, clinicamente pertinente e immunocompetente per esaminare le popolazioni di cellule tumorali e immunitarie nel cervello e la loro risposta al trattamento. Mentre la maggior parte dei modelli preclinici utilizza il trapianto ortotopico di linee cellulari tumorali consolidate, il sistema di modellazione qui presentato consente una rappresentazione "personalizzata" delle mutazioni tumorali specifiche del paziente in uno sviluppo graduale ma efficace da costrutti di DNA inseriti in cellule precursori neurali (NPC) in divisione in vivo. I costrutti di DNA presentano l'analisi a mosaico con il metodo MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), che consente la mutagenesi somatica a copia singola delle mutazioni driver. Utilizzando cuccioli di topo appena nati tra la nascita e i 3 giorni di età, gli NPC vengono presi di mira sfruttando queste cellule divisorie che rivestono i ventricoli laterali. La microiniezione di plasmidi di DNA (ad esempio, derivati da MADR, trasposoni, sgRNA diretti da CRISPR) nei ventricoli è seguita dall'elettroporazione utilizzando pale che circondano la regione rostrale della testa. Dopo la stimolazione elettrica, il DNA viene assorbito nelle cellule in divisione, con il potenziale di integrarsi nel genoma. L'uso di questo metodo è stato dimostrato con successo nello sviluppo di tumori cerebrali sia pediatrici che adulti, incluso il tumore cerebrale maligno più comune, il glioblastoma. Questo articolo discute e dimostra le diverse fasi dello sviluppo di un modello di tumore cerebrale utilizzando questa tecnica, compresa la procedura di anestesia di giovani cuccioli di topo, alla microiniezione della miscela plasmidico, seguita dall'elettroporazione. Con questo modello murino autoctono e immunocompetente, i ricercatori avranno la possibilità di espandere gli approcci di modellazione preclinica, nel tentativo di migliorare ed esaminare l'efficacia del trattamento del cancro.
Introduction
I modelli murini di tumore cerebrale sono cruciali per comprendere i meccanismi di formazione e trattamento del tumore cerebrale. I modelli attuali includono tipicamente trapianti sottocutanei o ortotopici prodotti rapidamente di linee cellulari tumorali comunemente usate, sulla base di un numero limitato di mutazioni driver o modelli di xenotrapianto derivati da pazienti, utilizzando topi immunodeficienti che ostacolano i corretti studi di immunoterapia 1,2,3,4. Inoltre, questi risultati preclinici possono portare a falsi positivi, in quanto tali modelli possono mostrare effetti drammatici, spesso curativi, in risposta alla terapia, ma questo non si traduce nella clinica 2,5,6,7. Avere la capacità di produrre rapidamente modelli murini preclinici geneticamente modificati che riflettano maggiormente le firme delle mutazioni dei pazienti è fondamentale per migliorare la validità dei risultati preclinici.
La somministrazione basata sull'elettroporazione (EP) di plasmidi di DNA per indurre mutazioni sia con perdita di funzione (LOF) che con guadagno di funzione (GOF) consente la generazione di tali modelli. Abbiamo sviluppato un metodo per una rappresentazione ancora più precisa delle mutazioni del driver GOF, chiamato analisi a mosaico con scambio di cassette mediato da doppia ricombinasi, o MADR8. Questo metodo consente l'espressione di uno o più geni di interesse in modo controllato e locus-specifico nelle cellule somatiche8. In combinazione con altri strumenti molecolari, come le ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR), diverse mutazioni dei pazienti possono essere combinate per sviluppare modelli murini di tumore cerebrale. Questo metodo è stato utilizzato per diversi tumori cerebrali pediatrici, tra cui gliomi ed ependimomi8, nonché modelli di tumore cerebrale adulto, come il glioblastoma (GBM).
Sebbene il metodo EP di modellazione tumorale non sia così comune come un trapianto, quanto segue dimostra finora la facilità e l'elevata riproducibilità di questo sistema di modellazione. I topi mTmG sono utilizzati per l'inserimento del DNA plasmidicoMADR 8,9. Questo sistema consente la ricombinazione dei siti bersaglio della ricombinasi (FRT) di loxP e Flp situati nel locus Rosa26 per il successivo inserimento del plasmide di DNA del donatore (cioè il gene GOF di interesse)8,9. Il seguente protocollo dimostra la semplicità di questo metodo dopo una pratica diligente e la capacità di sviluppare modelli di tumore cerebrale murino in modo autoctono e coerente.
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Protocol
Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Cedars Sinai Medical Center (IACUC). I topi omozigoti mTmG sono stati incrociati con topi C57BL/6J per ottenere cucciolate di topi mTmG eterozigoti di sesso misto da utilizzare nel seguente protocollo. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I cuccioli di topo sono stati elettropolizzati tra i giorni postnatali 0 e 3 (P0-P3).
1. Configurazione chirurgica
- Spruzzare sul tavolo operatorio un disinfettante chimico (ad es. Vimoba) e strofinare, seguito da etanolo al 70%, quindi pulire di nuovo.
- Posizionare i seguenti strumenti/materiali sul tavolo operatorio: pipette capillari in vetro tirato (vedere il riferimento10 su come estrarre le pipette), piccole forbici, contenitore per rifiuti di piccoli oggetti taglienti a rischio biologico, pipettatore da microlitri e puntali per pipette, 2 pezzi quadrati tagliati di pellicola di paraffina, gel per elettrodi, elettrodi, supporto per il microiniettore e miscela di plasmidi di DNA (vedere Tabella dei materiali e file supplementare 1).
- Posizionare i seguenti accessori sull'apparecchiatura sul tavolo operatorio o sul pavimento quando indicato: pannello di controllo del microiniettore, supporto e spina collegati alla macchina, supporto per tenere il supporto del microiniettore lateralmente (ausilio per la saldatura), pedale del microiniettore (sul pavimento), elettrodi collegati alla macchina e pedale dell'elettrodo (sul pavimento) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Il pedale dell'elettrodo è stato posizionato a destra del pedale del microiniettore come promemoria dell'ordine di utilizzo. - Accendere i pannelli di controllo del microiniettore e dell'elettrodo.
- Verificare che le impostazioni sul microiniettore siano corrette per l'esperimento: la pressione deve essere compresa tra 220-450 hPa, a seconda di come viene prelevata la miscela plasmidico.
- Verificare che le impostazioni sul pannello degli elettrodi siano corrette per l'esperimento.
NOTA: Per l'esperimento in corso (e per la maggior parte dei nostri modelli di tumore al cervello), vengono utilizzati cinque impulsi di 120 V (50 ms; separati da 950 ms).
2. Preparazione pre-chirurgica
- Preparare la miscela di plasmidi nel microiniettore.
- Recuperare una pipetta capillare in vetro estratta e inserirla nel supporto del microiniettore. Assicurarsi che la punta sia avvitata per tenerla in posizione.
- Tenere in una mano il porta microiniettore e con l'altra le forbicine; Posizionare la punta della pipetta su un piccolo contenitore per oggetti taglienti a rischio biologico. Con le forbici chiuse, premere leggermente sulla pipetta capillare in vetro allungata. Tagliare nel punto in cui si vede la curva, a circa 2 mm dall'apertura. Se il taglio sembra riuscito, posizionalo con cura di lato.
- Posizionare la provetta di miscela di plasmidi disponibile in commercio sul tavolo operatorio e aprirla. Tenere la scatola del puntale della pipetta o un altro oggetto dietro il fondo della provetta per mantenerla stabile durante l'estrazione della miscela plasmidico. Posizionare la pipetta di vetro collegata alla linea del microiniettore sul tavolo e inserirla delicatamente nella provetta della miscela plasmidico, assicurandosi che la punta sia ben inserita nella miscela vicino al fondo della provetta.
NOTA: A causa dell'aspirazione naturale per gravità, l'aspirazione della miscela plasmidica inizierà nella pipetta di vetro prima di aspirare attivamente. - Con la punta della pipetta di vetro nella miscela plasmidico, utilizzare il pannello del microiniettore per aumentare la quantità aspirata. Partendo da 0, ruotare la manopola destra e il quadrante in direzione negativa verso -60-questo porterà la miscela plasmidica nella pipetta di vetro. Portare solo ~ 1 pollice di miscela di plasmidi. Riportare la manopola su 0, quindi rimuovere il puntale della pipetta dalla miscela.
NOTA: Non rimuovere il puntale della pipetta dalla miscela mentre si trova nella direzione negativa, poiché ciò sparerà la miscela nel microiniettore ed eventualmente nel tubo. - Testare la quantità di miscela in un'iniezione iniettando la miscela su una striscia di film di paraffina. Utilizzare il pedale e premere una volta per iniettare la miscela sulla pellicola di paraffina. Utilizzare il pipettatore impostato a 1 μL per prelevare la miscela sul film di paraffina per vedere se è esattamente 1 μL.
NOTA: Se è leggermente inferiore a 1 μL, la pressione del microiniettore può essere aumentata. Se la pressione si avvicina a 450 hPa e ancora inferiore a 1 μL, l'apertura della pipetta di vetro è troppo piccola e dovrà essere tagliata di più. Si consiglia di rimettere la miscela plasmidica nella provetta prima del taglio. Nonostante ciò, ci sarà ancora una miscela residua sulle forbici, quindi è imperativo pulire accuratamente le forbici in seguito con DNase per rimuovere la miscela rimanente. Se l'iniezione è superiore a 1 μL, sarà necessario utilizzare una nuova pipetta di vetro tirata e tagliarla. Quando la quantità di test è esattamente di 1 μL, il puntale della pipetta in vetro è della dimensione giusta. - Ripetere il passaggio 2.1.4 per aspirare un'ulteriore miscela di plasmidi per la procedura, o circa 2-3 pollici nella pipetta di vetro tirata. Assicurarsi che la miscela non penetri troppo nel microiniettore dove non si può vedere la fine.
NOTA: Quando si aspira la miscela di plasmidi, è fondamentale evitare bolle d'aria. Se sono presenti bolle, è necessario ripetere questo passaggio rimuovendo la miscela plasmidica dalla pipetta di vetro tirata e ricominciando. Le bolle d'aria presenti saranno dannose per i passaggi successivi durante l'iniezione nel ventricolo del cucciolo. - Con la miscela di plasmidi pronta nella pipetta di vetro tirata, posizionare la pipetta pronta di lato sul supporto dell'ausilio di saldatura e in modo che non sia d'intralcio in modo da non toccarla/urtarla accidentalmente.
- Prepara gli animali per l'esperimento.
- Prepara un secchiello per il ghiaccio per anestetizzare i cuccioli. Aggiungere acqua al secchiello del ghiaccio per scioglierlo e aiutare a raffreddare il supporto per anestetizzante (ad es. parte superiore della scatola della pipetta).
- Metti la parte superiore della scatola sul ghiaccio sciolto a raffreddare.
- Rimuovere con cautela il/i cucciolo/i dalla gabbia e posizionarli nella parte superiore della scatola raffreddata, che rimane sul ghiaccio. Posiziona un'altra parte superiore senza stringere sopra il fondo per aiutare il processo di raffreddamento.
- Dopo 2-3 minuti, controlla i cuccioli. Separa i cuccioli l'uno dall'altro rimanendo in posizione prona.
NOTA: I cuccioli si dimeneranno, ma questo rallenterà quando l'anestesia fredda entra in azione. La parte superiore della scatola può essere lasciata per una facile visualizzazione dei cuccioli. - Per verificare la corretta anestesia, pizzica la coda del cucciolo e cerca una reazione. In caso di reazione, ripetere il passaggio 2.2.4. Se non viene emesso alcun stridio o poco movimento, il cucciolo è pronto per la procedura.
NOTA: I topi non devono essere tenuti sul ghiaccio per lunghi periodi di tempo in quanto ciò influirà sulla loro capacità di riprendersi dopo la procedura. Solo il numero di cuccioli che possono essere sia iniettati che elettroporati mentre sono ancora sotto anestesia deve essere messo in ghiaccio alla volta; Numeri maggiori si possono fare con l'esperienza.
3. Microiniezione di miscela di plasmidi di DNA nel ventricolo cerebrale
- Metti un cucciolo sul tavolo in posizione ventrale.
- Tira leggermente indietro la parte posteriore della testa per visualizzare le suture del cranio attraverso la pelle. Trova lambda sul cranio. Il ventricolo/sito di iniezione sarà a metà strada tra lambda e l'occhio.
NOTA: Lambda è il punto in cui le suture sagittale e lambdoide si intersecano. Si veda il riferimento11 per l'identificazione di lambda sul cranio del topo. - Forare la pelle con la punta della pipetta di vetro ad angolo perpendicolare (la pipetta è diritta verso il soffitto). Osservare una leggera rientranza concava quando si preme sul cranio e una resistenza iniziale. Una volta forato e il puntale della pipetta di vetro penetra attraverso la rientranza concava, viene raggiunto il livello di iniezione appropriato.
- Tenere il puntale della pipetta in vetro in posizione e premere una volta il pedale del microiniettore per iniettare 1 μL della miscela plasmidico.
NOTA: Ci sono due modi per vedere chiaramente che l'iniezione è andata a buon fine. Innanzitutto, chiedi a un altro membro del laboratorio di osservare la miscela di plasmidi che scende nella pipetta di vetro mentre viene iniettata. Inoltre, se si utilizza il verde veloce o un altro colorante nella miscela di plasmidi, il colorante si diffonderà visibilmente nel ventricolo sotto la pelle una volta iniettato ed è facilmente visibile quando viene tenuto vicino a una lampada chirurgica.
4. Elettroporazione
- Metti un pezzo di pellicola di paraffina (un quadrato) sul tavolo e spremi il gel dell'elettrodo sopra la pellicola. Coprire le pale degli elettrodi con gel per elettrodi spennellando una generosa quantità su ciascuna paletta. Il gel in eccesso che gocciola può essere rimosso su un tovagliolo di carta.
NOTA: Dopo il primo EP, non lasciare che il gel di ciascuna paletta tocchi l'altro lato. Questo trasferirà la carica e, quando si applica alla testa del cucciolo, si sentirà un suono sfrigolante. Ciò accadrà anche se il gel sulla testa del cucciolo da un elettrodo entra in contatto con il gel da un altro.
ATTENZIONE: Prestare attenzione a tenere le dita lontane dalle pale durante l'elettroporazione. - Tieni il corpo del cucciolo in una mano (in genere la mano non dominante), tenendo le dita ben dietro la testa.
NOTA: Se si è destrimani, è più facile tenere il cucciolo con la mano sinistra e gli elettrodi con la destra. Se sei mancino, fai il contrario. - Avvicinare gli elettrodi alla testa del cucciolo per assicurarsi che siano nella posizione corretta, con l'elettrodo positivo all'esterno della testa dove viene puntato il ventricolo (ad esempio, se si prende di mira il ventricolo sinistro, posizionare il positivo sul lato sinistro del cucciolo e il negativo sul lato destro del cucciolo). Durante il posizionamento degli elettrodi, far scorrere delicatamente un dito (in genere il pollice) sul lato dorsale del corpo/collo posteriore alla testa per aiutare a sollevare la testa in posizione.
- Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la coda e procedere con l'elettroporazione solo se il cucciolo si trova nel piano di anestesia appropriato. Schiacciare leggermente le piastre degli elettrodi sulla parte rostrale della testa del topo, posizionandole sopra gli occhi. Premere una volta il pedale dell'elettrodo per avviare l'elettroporazione. Questo protocollo utilizza cinque impulsi di 120 V (50 ms, separati da 950 ms); Ogni impulso sarà udibile.
- Ad ogni impulso, ruotare leggermente le palette dell'elettrodo in senso antiorario in modo che la paletta positiva si muova verso la parte superiore della testa.
NOTA: Con un'adeguata elettroporazione, si sentirà/vedrà il corpo del cucciolo di topo contrarsi ad ogni impulso.
- Ad ogni impulso, ruotare leggermente le palette dell'elettrodo in senso antiorario in modo che la paletta positiva si muova verso la parte superiore della testa.
- Dopo l'ultimo impulso, rimuovere le pale e metterle da parte. Sposta il cucciolo su un tovagliolo di carta pulito e chiedi a un altro membro del laboratorio di pulire il gel dalla testa del cucciolo e di posizionarlo sotto una lampada riscaldante su una "barca" di carta assorbente.
NOTA: Assicurarsi che la lampada riscaldante non sia troppo vicina ai cuccioli. Assicurati di avere un altro membro del laboratorio che ti aiuti in questo passaggio e tieni d'occhio costantemente i cuccioli. Spesso aiuta a tenere i cuccioli in mano sotto la lampada riscaldante per aumentare il calore per il cucciolo. Anche massaggiare delicatamente l'addome del cucciolo può aiutare il recupero. - Riporta i cuccioli nella gabbia di casa una volta che i loro corpi hanno un sano colore rosato e hanno una risposta cigolante a un leggero pizzicotto della coda.
NOTA: Prima di rimetterli nella gabbia, prendi una piccola quantità di materiale per la lettiera della gabbia domestica e spazzola leggermente i cuccioli con esso per l'odore della gabbia. Rimetti i cuccioli nella gabbia sotto il materiale della lettiera e torna nella stanza di detenzione.
5. Fasi post-chirurgiche
- Riportare la miscela di plasmidi inutilizzata dalla pipetta di vetro del microiniettore alla provetta. Se è rimasta una miscela sufficiente, questa può essere utilizzata nelle procedure future. Conservare a -20 °C.
- Rimuovere il gel dalle piastre degli elettrodi con carta assorbente.
- Riportare tutte le parti dell'apparecchiatura al loro posto originale.
NOTA: Se sono state utilizzate delle forbici per tagliare il puntale della pipetta di vetro dopo che la miscela di plasmidi è stata prelevata, lasciare le forbici fuori per pulire accuratamente con la soluzione DNasi. - Spruzzare sul tavolo un disinfettante chimico, quindi pulire, seguito da uno spruzzo di etanolo al 70%, quindi pulire di nuovo.
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Representative Results
Il protocollo sopra descritto è stato utilizzato per sviluppare con successo modelli murini di tumore cerebrale sia pediatrico che adulto, con il primo pubblicato in dettaglio su Kim et al.8. Con una tecnica adeguata e un'attenta pianificazione della progettazione dei plasmidi, il successo per lo sviluppo di EP dei tumori è in genere del 100%. L'istologia è il modo più rapido e semplice per verificare il successo dell'inserimento del plasmide del DNA quando viene utilizzata una proteina reporter. Questo protocollo prevede fasi su come sviluppare un modello di tumore cerebrale GBM con penetranza del 100%, come confermato dall'analisi istologica. Un plasmide donatore MADR esprimeva sia una proteina reporter (smTagBFP2-V5) che SpCas9 (Supplementary File 1). Sono stati inclusi anche due RNA a guida singola (sgRNA) del gene oncosoppressore LOF a forte driver, diretti a Nf1 e Trp53 (vedere il riferimento12 per la strategia di clonaggio dell'sgRNA; vedere il file supplementare 1 per le sequenze oligonucleotidiche utilizzate in questo protocollo). Infine, i plasmidi ricombinasi Cre e Flp sono stati aggiunti alla miscela plasmidica per la ricombinazione nel locus Rosa26 (Figura 1A; vedi File supplementare 1). I topi erano moribondi entro 5 mesi dall'EP, con la piena crescita del tumore rilevata attraverso la proteina reporter e l'analisi istologica (Figura 1B).
Figura 1: Colorazione immunofluorescente della crescita tumorale di successo a 5 mesi dopo EP . (A) Plasmide donatore MADR per spCas9 e la proteina reporter TagBFP2-V5. Nel mix di plasmidi era incluso anche un plasmide ricombinasico Cre-Flp, insieme a sgRNA diretti a Nf1 e Trp53. (B) Una sezione coronale prelevata a 5 mesi dopo l'EP di un tumore GBM guidato da Nf1 e Trp53 LOF. Le cellule tumorali sono marcate con la proteina reporter TagBFP-V5 legata a spCas9 (B3). Viene rilevata anche la marcatura EGFP sparsa (B2) insieme a tutte le cellule che non hanno espresso i plasmidi marcati con tdTomato (B1). Barra della scala = 1.000 μm. Abbreviazioni: Ctx = corteccia; CC = corpo calloso; LV = ventricolo laterale; Str = striato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Fascicolo supplementare 1: Sequenze plasmidiche. Sequenze complete di tutti i plasmidi e oligonucleotidi utilizzati in questo protocollo, tra cui pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre e gli oligonucleotidi per gli sgRNA che hanno come bersaglio Trp53 e Nf1. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La somministrazione di DNA plasmidico basata sull'elettroporazione consente l'uso in vivo della biologia molecolare, simile a quella utilizzata nei modelli murini geneticamente modificati, ma con la velocità, la localizzazione e l'efficienza della trasduzione virale 8,13,14. Con quest'ultimo, tuttavia, arrivano problemi di sicurezza e risposte immunitarie. Abbiamo dimostrato nel nostro sistema di modellizzazione che utilizza la somministrazione di EP del DNA plasmidico che la risposta immunitaria minima si verifica a causa dell'inserimento iniziale della pipetta capillare di vetro nel ventricolo cerebrale8. Pertanto, per migliorare gli attuali sistemi di modellazione tumorale per l'immunoterapia, il protocollo presentato sopra consente un sistema di modellazione preclinica più conveniente e robusto per i tumori cerebrali.
Il primo passo cruciale per il successo della modellazione del tumore cerebrale con questo metodo è la progettazione del plasmide. Sebbene non sia descritto in questo protocollo, è stato ampiamente discusso in Kim et al.8 e Rincon Fernandez Pacheco et al.10 per modelli di tumore cerebrale pediatrico, nonché altre fonti per usi aggiuntivi15,16. Mentre il nostro laboratorio ha elettroporato con successo fino a sei plasmidi, ci sarà un limite superiore alla quantità di DNA che può essere consegnata. Questo limite superiore è vincolato dalla concentrazione di DNA plasmidico, dalle dimensioni dei plasmidi, dal voltaggio e dal volume di DNA erogato, che è a sua volta limitato dalle dimensioni del ventricolo cerebrale all'età dell'elettroporazione. Inoltre, con più plasmidi di DNA nella miscela, è imperativo avere una miscela di plasmidi ben sospesa prima dell'iniezione. Se la miscela non viene risospesa bene, sarà difficile prelevarla nella stretta pipetta capillare in vetro. Inoltre, con la corretta miscela di plasmidi, l'aggiunta di colorante verde rapido (10% v/v) consente una chiara visualizzazione della miscela di plasmidi assorbita nel ventricolo cerebrale durante la somministrazione (passaggio 3.4). Un avvertimento importante a questo, tuttavia, è che il colorante può interferire con la colorazione degli anticorpi nelle lunghezze d'onda del rosso lontano (ad esempio, Cy5) del tessuto processato entro diverse settimane dopo EP8. Sebbene il colorante verde veloce sia molto utile quando si impara per la prima volta l'EP, può essere eliminato per evitare la colorazione di falsi positivi. Vale la pena tenere presente che, per la fase 3.4, l'erogazione della miscela plasmidica nel ventricolo non sarà visibile, quindi sarà fondamentale osservare la pipetta di vetro affinché il volume diminuisca man mano che viene iniettata.
Per garantire la coerenza e la corretta gestione delle iniezioni, ci sono diversi fattori da tenere a mente: 1) il volume di iniezione. Sebbene possano essere necessari diversi tentativi per tagliare con precisione la pipetta capillare in vetro (passaggio 2.1.2), è fondamentale che venga iniettato solo 1 μL di miscela plasmidica per ciascun animale. L'aumento o la diminuzione del volume tra gli animali influenzerà sicuramente la latenza della formazione del tumore. 2) Una volta impostato il volume di iniezione, i parametri del microiniettore non devono essere modificati, in quanto ciò influirà sul volume. 3) Una volta che la miscela di plasmidi viene portata nella pipetta capillare di vetro, la pipetta deve essere tenuta lontana in modo da non colpire accidentalmente se stessi o gli altri. A tale scopo è utile l'uso di un supporto per micropipette (ausilio per la saldatura; vedere la tabella dei materiali) che si aggancia al supporto del microiniettore. Tuttavia, se la miscela di plasmidi non viene iniettata subito dopo, è probabile che ostruisca la punta. Pertanto, è importante eseguire una microiniezione di prova su un pezzo di parafilm immediatamente prima dell'iniezione nel ventricolo cerebrale per assicurarsi che non vi siano ostruzioni che bloccano l'orifizio. Infine, come ogni altra tecnica chirurgica, l'esecuzione del protocollo è diversa per ogni individuo. È quindi imperativo avere lo stesso tecnico che esegue la microiniezione e/o l'EP per tutti i gruppi di topi in un esperimento.
I modelli di tumore cerebrale sviluppati nel nostro laboratorio si sono concentrati sui gliomi. Da un punto di vista neurobiologico, l'esecuzione di questo metodo tra i giorni postnatali 0-3 mira al periodo di gliogenesi e al periodo post-neurogenesi embrionale. L'interesse per i tumori cerebrali alternativi può richiedere un aggiustamento del punto temporale e/o della posizione degli elettrodi. Sono disponibili diversi protocolli per l'EP in utero che sarebbero pertinenti per i tumori su base neurale15,17,18.
Ci sono alcune limitazioni a questo metodo. La capacità di clonare e mescolare e abbinare plasmidi di DNA LOF e GOF utilizzando CRISPR, trasposoni e, più recentemente, il sistema MADR consente di modellare infinite combinazioni di mutazioni dei pazienti. Le tecniche di microiniezione ed EP sono relativamente semplici, anche se richiedono alcuni tentativi di pratica per migliorare e diventare coerenti. Un limite del modello presentato è il tempo necessario al tumore GBM per svilupparsi completamente (5 mesi). Nonostante ciò, stiamo attualmente lavorando su ulteriori modelli che utilizzano mutazioni tumorali comuni dei pazienti che portano a una crescita tumorale aggressiva che dura meno di 2 mesi. Oltre alle limitazioni, l'attrezzatura stessa è un investimento iniziale sostanziale (circa $ 20.000- $ 30.000); Tuttavia, la capacità di elettropolizzare decine se non centinaia di topi in una sola seduta consente una potenza incredibile per un esperimento preclinico. Detto questo, se ci sono problemi con l'allevamento dei topi, questo può diventare il limite più grande, poiché è imperativo avere riproduttori sani e cucciolate sane.
Sono passati diversi decenni da quando si sono verificati progressi nei trattamenti dei tumori cerebrali, con l'ultimo più grande miglioramento del chemioterapico Temozolomide che ha esteso la sopravvivenza solo di pochi mesi19. L'immunoterapia ha rivoluzionato molti tumori diversi, ma deve ancora avere un impatto significativo sullo standard di cura in neuro-oncologia. È interessante notare che i modelli di tumore cerebrale murino attualmente utilizzati hanno mostrato un grande successo con l'immunoterapia, ma continuamente non riescono a tradursi nella clinica e a mostrare successo con i pazienti. È quindi imperativo fare un passo indietro e rivalutare i modelli murini di tumore utilizzati. I modelli attuali si basano sull'utilizzo di linee cellulari più vecchie con mutazioni limitate che non si trovano comunemente nei pazienti, iniettando migliaia di cellule nel cervello. Con la tecnica discussa in questo protocollo, vengono ricapitolati diversi profili di mutazione tumorale del paziente in un modello murino, consentendo uno sviluppo autoctono e graduale dei tumori entro un lasso di tempo che consentirebbe test preclinici in topi immunocompetenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Gi Bum Kim per la colorazione e le immagini immunofluorescenti. Ringraziamo anche Emily Hatanaka, Naomi Kobritz e Paul Linesch per gli utili consigli sul protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
