Summary
Att använda en immunkompetent, autokton tumörmodell som drivs av vanliga patientmutationer för preklinisk testning är avgörande för immunterapeutisk testning. Detta protokoll beskriver en metod för att generera musmodeller av hjärntumörer med hjälp av elektroporationsbaserad leverans av plasmid-DNA som representerar vanliga patientmutationer, vilket ger en exakt, reproducerbar och konsekvent musmodell.
Abstract
Tumörmodeller är avgörande för preklinisk testning av hjärntumörer när det gäller att utforska nya, mer effektiva behandlingar. Med ett stort intresse för immunterapi är det ännu viktigare att ha en konsekvent, kliniskt relevant, immunkompetent musmodell för att undersöka tumör- och immuncellspopulationerna i hjärnan och deras svar på behandling. Medan de flesta prekliniska modeller använder ortotopisk transplantation av etablerade tumörcellinjer, möjliggör modelleringssystemet som presenteras här en "personlig" representation av patientspecifika tumörmutationer i en gradvis, men ändå effektiv utveckling från DNA-konstruktioner som sätts in i delande neurala prekursorceller (NPC) in vivo. DNA-konstruktioner innehåller mosaikanalys med MADR-metoden (dual-recombinase-mediated cassette exchange), vilket möjliggör somatisk mutagenes av drivarmutationer i en kopia. Med hjälp av nyfödda musungar mellan födseln och 3 dagar gamla riktar man in sig på NPC:er genom att dra nytta av dessa delande celler som kantar de laterala ventriklarna. Mikroinjektion av DNA-plasmider (t.ex. MADR-härledda, transposoner, CRISPR-riktat sgRNA) i ventriklarna följs av elektroporering med hjälp av paddlar som omger huvudets rostrala region. Vid elektrisk stimulering tas DNA:t upp i de delande cellerna, med potential att integreras i arvsmassan. Användningen av denna metod har framgångsrikt visats vid utveckling av hjärntumörer hos både barn och vuxna, inklusive den vanligaste elakartade hjärntumören, glioblastom. Den här artikeln diskuterar och demonstrerar de olika stegen för att utveckla en hjärntumörmodell med hjälp av denna teknik, inklusive proceduren för att bedöva unga musvalpar, till mikroinjektion av plasmidblandningen, följt av elektroporering. Med denna autoktona, immunkompetenta musmodell kommer forskare att ha möjlighet att utöka prekliniska modelleringsmetoder i försök att förbättra och undersöka effektiv cancerbehandling.
Introduction
Murina hjärntumörmodeller är avgörande för att förstå mekanismerna för bildning och behandling av hjärntumörer. Nuvarande modeller inkluderar vanligtvis snabbt producerade subkutana eller ortotopiska transplantationer av vanliga tumörcellinjer, baserat på ett begränsat antal drivarmutationer eller patienthärledda xenograftmodeller, med immundefekta möss som hindrar korrekta immunterapistudier 1,2,3,4. Dessutom kan dessa prekliniska resultat leda till falskt positiva resultat, eftersom sådana modeller kan uppvisa dramatiska, ofta botande effekter som svar på behandling, men detta översätts inte till kliniken 2,5,6,7. Att snabbt kunna producera genetiskt modifierade prekliniska musmodeller som bättre återspeglar patientens mutationssignaturer är absolut nödvändigt för att förbättra validiteten av prekliniska resultat.
Elektroporering (EP)-baserad leverans av DNA-plasmider för att inducera mutationer i både funktionsförlust (LOF) och förstärkning av funktion (GOF) möjliggör generering av sådana modeller. Vi utvecklade en metod för en ännu mer exakt representation av GOF-drivrutinsmutationer som kallas mosaikanalys med dual-recombinase-medierat kassettutbyte, eller MADR8. Denna metod gör det möjligt att uttrycka en gen (eller gener) av intresse på ett kontrollerat, lokusspecifikt sätt i somatiska celler8. I kombination med andra molekylära verktyg, såsom clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), kan olika patientmutationer kombineras för att utveckla hjärntumörmodeller hos möss. Denna metod har använts för olika hjärntumörer hos barn, inklusive gliom och ependymom8, samt modeller för hjärntumörer hos vuxna, såsom glioblastom (GBM).
Även om EP-metoden för tumörmodellering inte är lika vanlig som en transplantation, visar följande hittills hur enkelt och reproducerbart detta modelleringssystem är. mTmG-möss används för införande av MADR-plasmid-DNA 8,9. Detta system möjliggör rekombination av loxP- och Flp-rekombinasmålplatser (FRT) belägna på Rosa26-platsen för efterföljande införande av donator-DNA-plasmiden (dvs. GOF-genen av intresse)8,9. Följande protokoll visar hur enkel denna metod är efter flitig övning och förmågan att utveckla modeller av hjärntumörer hos möss på ett inhemskt och konsekvent sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer i detta protokoll har godkänts av Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Homozygota mTmG-möss parades med C57BL/6J-möss för att få kullar av heterozygota mTmG-möss av blandat kön för användning i följande protokoll. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). Musungarna elektroporerades mellan postnatal dag 0 och 3 (P0-P3).
1. Kirurgisk inställning
- Spraya operationsbordet med kemiskt desinfektionsmedel (t.ex. Vimoba) och torka av, följt av 70 % etanol, och torka av igen.
- Placera följande instrument/material på operationsbordet: kapillärpipetter av draget glas (se referens10 om hur man drar pipetter), en liten sax, en liten avfallsbehållare för vassa föremål med biologisk risk, en mikroliterpipett och pipettspetsar, 2x skurna fyrkantiga bitar av paraffinfilm, elektrodgel, elektroder, hållare för mikroinjektorn och DNA-plasmidblandning (se materialtabell och kompletterande fil 1).
- Placera följande tillbehör på utrustningen på operationsbordet eller på golvet när så anges: mikroinjektorkontrollpanel, hållare och plugg ansluten till maskinen, stativ för att hålla mikroinjektorhållaren åt sidan (lödhjälpmedel), mikroinjektorfotpedal (på golvet), elektroder fästa på maskinen och elektrodfotpedal (på golvet) (se materialtabell).
OBS: Elektrodfotpedalen placerades till höger om mikroinjektorns fotpedal som en påminnelse om användningsordningen. - Slå på mikroinjektorn och elektrodkontrollpanelerna.
- Kontrollera att inställningarna på mikroinjektorn är korrekta för experimentet: trycket måste vara mellan 220-450 hPa, beroende på hur plasmidblandningen tas upp.
- Kontrollera att inställningarna på elektrodpanelen är korrekta för experimentet.
OBS: För det aktuella experimentet (och de flesta av våra hjärntumörmodeller) används fem pulser på 120 V (50 ms; separerade med 950 ms).
2. Förberedelse före operationen
- Bered plasmidblandningen i mikroinjektorn.
- Ta upp en kapillärpipett av utdraget glas och sätt in den i mikroinjektorhållaren. Se till att spetsen är fastskruvad för att hålla den på plats.
- Håll mikroinjektorhållaren i ena handen och den lilla saxen med den andra; Ha spetsen på pipetten över en liten behållare för vassa biologiska faror. Med saxen stängd, tryck lätt ner den förlängda glaskapillärpipetten. Såga där böjen syns, ca 2 mm från öppningen. Om snittet ser lyckat ut, lägg försiktigt åt sidan.
- Placera det kommersiellt tillgängliga plasmidblandningsröret platt på operationsbordet och öppna. Ha pipettspetslådan eller något annat föremål bakom botten av röret för att hålla det stabilt medan du drar upp plasmidblandningen. Placera glaspipetten som är fäst vid mikroinjektorlinjen platt på bordet och för försiktigt in i röret med plasmidblandningen, se till att spetsen ligger väl i blandningen nära botten av röret.
OBS: På grund av naturlig gravitationssugning kommer plasmidblandningssugningen att börja i glaspipetten innan den aktivt dras in. - Med spetsen på glaspipetten i plasmidblandningen, använd mikroinjektorpanelen för att öka mängden som dras in. Börja vid 0, vrid på den högra ratten och vrid i negativ riktning mot -60-detta kommer att föra plasmidblandningen in i glaspipetten. Ta bara in ~1 tum plasmidblandning. Vrid tillbaka vredet till 0 och ta sedan bort pipettspetsen från blandningen.
OBS: Ta inte bort pipettspetsen från blandningen när den är i negativ riktning, eftersom detta kommer att skjuta blandningen in i mikroinjektorn och eventuellt in i slangen. - Testa mängden blandning i en injektion genom att injicera blandningen på en remsa paraffinfilm. Använd fotpedalen och tryck en gång för att injicera blandningen på paraffinfilmen. Använd pipettoren inställd på 1 μL för att ta upp blandningen på paraffinfilmen för att se om den är exakt 1 μL.
OBS: Om det är något mindre än 1 μL kan trycket på mikroinjektorn ökas. Om trycket närmar sig 450 hPa och fortfarande är mindre än 1 μL är glaspipettöppningen för liten och måste trimmas mer. Det rekommenderas att sätta tillbaka plasmidblandningen i röret innan trimning. Trots detta kommer det fortfarande att finnas en restblandning på saxen, så det är absolut nödvändigt att rengöra saxen noggrant efteråt med DNase för att ta bort eventuell kvarvarande blandning. Om injektionen är större än 1 μl måste en ny pipett av utdraget glas användas och trimmas. När testmängden är exakt 1 μL har glaspipettspetsen rätt storlek. - Upprepa steg 2.1.4 för att dra in ytterligare plasmidblandning för proceduren, eller cirka 2-3 tum in i den utdragna glaspipetten. Se till att blandningen inte går för långt in i mikroinjektorn där man inte kan se slutet.
OBS: När du ritar i plasmidblandningen är det viktigt att undvika luftbubblor. Om det finns bubblor är det nödvändigt att göra om detta steg genom att ta bort plasmidblandningen från den dragna glaspipetten och börja om. Luftbubblor som finns kommer att vara skadliga för följande steg när du injicerar i kammarens kammare. - Med plasmidblandningen redo i den dragna glaspipetten, placera den färdiga pipetten åt sidan på lödhjälpsstativet och ur vägen för att inte råka vidröra/stöta till den.
- Förbered djuren för försöket.
- Förbered en ishink för att bedöva valpar. Tillsätt vatten i ishinken för att smälta och hjälp till att kyla bedövningshållaren (t.ex. pipettlådans topp).
- Placera lådans topp på den smälta isen för att svalna.
- Ta försiktigt bort valparna från buren och placera dem i den kylda lådan, som ligger kvar på isen. Placera en annan topp löst över botten för att underlätta kylningsprocessen.
- Efter 2-3 min, kolla till valparna. Separera valparna från varandra medan du förblir i bukläge.
OBS: Valparna kommer att slingra sig, men detta kommer att sakta ner när den kalla bedövningen börjar. Lådans topp kan lämnas av för enkel visning av valparna. - För att kontrollera om bedövningen är korrekt, nyp ihop valpens svans och leta efter en reaktion. Om det finns en reaktion, upprepa steg 2.2.4. Om inget skrik eller liten rörelse görs är valpen redo för proceduren.
OBS: Möss bör inte hållas på is under längre perioder eftersom detta kommer att påverka deras förmåga att återhämta sig efter ingreppet. Endast det antal valpar som kan både injiceras och elektroporeras medan de fortfarande är nedsövda får läggas på is åt gången. Större antal kan göras med erfarenhet.
3. Mikroinjektion av DNA-plasmidblandning i hjärnkammaren
- Placera en valp på bordet i ventralt läge.
- Dra tillbaka något på baksidan av huvudet för att visualisera skallens suturer genom huden. Hitta lambda på skallen. Ventrikeln/injektionsstället kommer att ligga halvvägs mellan lambda och ögat.
OBS: Lambda är där sagittal- och lambdoidsuturerna korsar varandra. Se referens11 för identifiering av lambda på musskallen. - Stick hål i huden med glaspipettspetsen i en vinkelrät vinkel (pipetten är rakt upp mot taket). Observera en liten konkav fördjupning när du trycker på skallen och ett initialt motstånd. När den väl är genomborrad och glaspipettspetsen sticker ut genom den konkava fördjupningen, uppnås lämplig injektionsnivå.
- Håll glaspipettspetsen på plats och tryck på mikroinjektorns fotpedal en gång för att injicera 1 μL av plasmidblandningen.
OBS: Det finns två sätt att tydligt se att injektionen lyckades. Låt först en annan labbmedlem titta på plasmidblandningen som går ner i glaspipetten när den injiceras. Dessutom, om du använder snabbt grönt eller annat färgämne i plasmidblandningen, kommer färgämnet synligt att spridas ut i kammaren under huden när det injiceras och är lätt synligt när det hålls upp mot en kirurgisk lampa.
4. Elektroporering
- Lägg en bit paraffinfilm (en kvadrat) på bordet och pressa ut elektrodgelen ovanpå filmen. Täck elektrodpaddlarna med elektrodgel genom att borsta en generös mängd på varje paddel. Eventuell överflödig gel som droppar av kan svepas av på en pappershandduk.
OBS: Efter den första EP:n, låt inte gelen från varje paddel vidröra den andra sidan. Detta kommer att överföra laddningen och när den appliceras på valpens huvud kan ett fräsande ljud höras. Detta kommer också att hända om gelen på valpens huvud från en elektrod kommer i kontakt med gelen från en annan.
VARNING: Försiktighet måste iakttas för att hålla fingrarna borta från paddlarna under elektroporeringen. - Håll valpens kropp i ena handen (vanligtvis den icke-dominanta handen) och håll fingrarna långt bakom huvudet.
OBS: Om du är högerhänt är det lättast att hålla valpen med vänster hand och elektroder med höger. Om du är vänsterhänt, gör tvärtom. - För elektroderna nära valpens huvud för att säkerställa att de är i rätt läge, med den positiva elektroden på utsidan av huvudet där kammaren riktas (t.ex. om du riktar in dig på vänster kammare, placera den positiva på valpens vänstra sida och den negativa på valpens högra sida). Medan du placerar elektroderna, skjut försiktigt ett finger (vanligtvis tummen) på den dorsala sidan av kroppen/nacken bakom huvudet för att hjälpa till att höja huvudet på plats.
- Kontrollera anestesidjupet genom att nypa ihop svansen och fortsätt med elektroporering endast om valpen befinner sig i lämpligt anestesiplan. Kläm lätt ihop elektrodpaddlarna på den rostrala delen av mushuvudet och placera dem över ögonen. Tryck på elektrodfotpedalen en gång för att starta elektroporeringen. Detta protokoll använder fem pulser på 120 V (50 ms, separerade med 950 ms); Varje puls kommer att höras.
- Vid varje puls vrider du elektrodpaddlarna något moturs så att den positiva paddeln rör sig mot toppen av huvudet.
OBS: Med korrekt elektroporering kommer man att känna/se musvalpens kropp rycka med varje puls.
- Vid varje puls vrider du elektrodpaddlarna något moturs så att den positiva paddeln rör sig mot toppen av huvudet.
- Efter den sista pulsen, ta bort paddlarna och placera dem åt sidan. Flytta valpen till en ren pappershandduk och låt en annan labbmedlem rengöra gelén från valpens huvud och placera den under en värmelampa på en "båt" av pappershanddukar.
OBS: Se till att värmen lamp är inte för nära valparna. Se till att ha en annan labbmedlem som hjälper till med detta steg och håll ett konstant öga på valparna. Det hjälper ofta att hålla valparna i handen under värmelampan för att öka värmen för valpen. Att försiktigt massera valpens buk kan också hjälpa till med återhämtningen. - Sätt tillbaka valparna i hemburen när deras kroppar har en frisk rosa färg och har ett pipande svar på ett lätt svansnyp.
OBS: Innan du sätter tillbaka dem i buren, ta en liten mängd av hemburens strömaterial och borsta valparna lätt med det för burdoften. Sätt tillbaka ungarna i buren under strömaterialet och återgå till djurhållningsrummet.
5. Åtgärder efter operationen
- Sätt tillbaka den oanvända plasmidblandningen från mikroinjektorns glaspipett till röret. Om det finns tillräckligt med blandning kvar kan detta användas i framtida procedurer. Förvaras vid -20 °C.
- Torka av gelen från elektrodpaddlarna med hushållspapper.
- Sätt tillbaka alla utrustningsdelar på sin ursprungliga plats.
OBS: Om sax användes för att klippa glaspipettspetsen efter att plasmidblandningen togs upp, lämna saxen ute för att rengöra noggrant med DNase-lösning. - Spraya ner bordet med ett kemiskt desinfektionsmedel, torka sedan av, följt av en sprayning av 70 % etanol, torka sedan av igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs ovan har använts för att framgångsrikt utveckla musmodeller för både pediatriska och vuxna hjärntumörer, och den förstnämnda har publicerats i detalj i Kim et al.8. Med rätt teknik och noggrann planering av plasmiddesign är framgången för EP-utveckling av tumörer vanligtvis 100 %. Histologi är det snabbaste och enklaste sättet att kontrollera om DNA-plasmidinsättningen lyckas när ett reporterprotein används. Detta protokoll omfattar steg för hur man utvecklar en GBM-hjärntumörmodell med 100 % penetrans, vilket bekräftas av histologisk analys. En MADR-donatorplasmid uttryckte både ett reporterprotein (smTagBFP2-V5) och SpCas9 (Supplementary File 1). Två starka drivande LOF tumörsuppressorgen-enkelguide-RNA (sgRNA) inkluderades också, riktade mot Nf1 och Trp53 (se referens12 för sgRNA-kloningsstrategi; se tilläggsfil 1 för oligonukleotidsekvenser som används i detta protokoll). Slutligen tillsattes Cre- och Flp-rekombinasplasmiderna till plasmidblandningen för rekombination på Rosa26-lokus (Figur 1A; se tilläggsfil 1). Mössen var döende 5 månader efter EP, med full tumörtillväxt detekterad genom reporterproteinet och histologisk analys (Figur 1B).
Figur 1: Immunofluorescensfärgning av framgångsrik tumörtillväxt 5 månader efter EP . (A) MADR-donatorplasmid för spCas9 och reporterproteinet TagBFP2-V5. I plasmidblandningen ingick också en Cre-Flp rekombinasplasmid, tillsammans med sgRNA riktade mot Nf1 och Trp53. (B) Ett koronalt snitt taget 5 månader efter EP av en GBM-tumör driven av Nf1 och Trp53 LOF. Tumörcellerna är märkta med TagBFP-V5 reporterprotein kopplat till spCas9 (B3). Gles EGFP-märkning detekteras också (B2) tillsammans med alla celler som inte uttryckte plasmiderna märkta med tdTomato (B1). Skalstapel = 1 000 μm. Förkortningar: Ctx = cortex; CC = corpus callosum; LV = lateral ventrikel; Str = striatum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Plasmidsekvenser. Kompletta sekvenser av alla plasmider och oligonukleotider som används i detta protokoll, inklusive pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre och oligonukleotiderna för sgRNA som riktar sig mot Trp53 och Nf1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporationsbaserad leverans av plasmid-DNA möjliggör in vivo-användning av molekylärbiologi, liknande den som används i genetiskt modifierade musmodeller, men med hastigheten, lokaliseringen och effektiviteten hos viral transduktion 8,13,14. Med det senare kommer dock säkerhetsproblem såväl som immunsvar. Vi har visat i vårt modelleringssystem med EP-leverans av plasmid-DNA att minimalt immunsvar uppstår på grund av den initiala insättningen av glaskapillärpipetten i hjärnkammaren8. Därför, för att förbättra de nuvarande tumörmodelleringssystemen för immunterapi, möjliggör protokollet som presenteras ovan ett mer ändamålsenligt och robust prekliniskt modelleringssystem för hjärntumörer.
Det första avgörande steget för framgångsrik modellering av hjärntumörer med denna metod är plasmiddesign. Även om det inte beskrivs i detta protokoll, har det diskuterats utförligt i Kim et al.8 och Rincon Fernandez Pacheco et al.10 för pediatriska hjärntumörmodeller, såväl som andra källor för ytterligare användningsområden15,16. Även om vårt laboratorium framgångsrikt har elektroporerat upp till sex plasmider, kommer det att finnas en övre gräns för hur mycket DNA som kan levereras. Denna övre gräns begränsas av plasmid-DNA-koncentration, plasmidstorlekar, spänning och volymen av DNA som levereras, vilket i sig begränsas av storleken på hjärnkammaren vid elektroporationsåldern. Dessutom, med flera DNA-plasmider i blandningen, är det absolut nödvändigt att ha en väl suspenderad plasmidblandning före injektion. Om blandningen inte återsuspenderas väl blir det svårt att ta upp den i den smala glaskapillärpipetten. Dessutom, med rätt plasmidblandning, möjliggör tillsatsen av ett snabbt grönt färgämne (10 % v/v) en tydlig visning av plasmidblandningen som tas upp i hjärnkammaren under administrering (steg 3.4). En viktig invändning mot detta är dock att färgämnet kan störa antikroppsfärgningen i de långröda våglängderna (t.ex. Cy5) av vävnad som bearbetas inom flera veckor efter EP8. Även om det snabba gröna färgämnet är till stor hjälp när man först lär sig EP, kan det elimineras för att undvika falskt positiva färgningar. Det är värt att komma ihåg att för steg 3.4 kommer tillförseln av plasmidblandningen i kammaren inte att vara synlig, så det kommer att vara avgörande att titta på glaspipetten för att volymen ska minska när den injiceras.
För konsekvens och korrekt hantering av injektioner finns det flera faktorer att tänka på: 1) injektionsvolymen. Även om det kan krävas flera försök för att skära glaskapillärpipetten exakt (steg 2.1.2), är det avgörande att endast 1 μL plasmidblandning injiceras för varje djur. Ökningar eller minskningar av volymen mellan djur kommer säkert att påverka latensen för tumörbildning. 2) När injektionsvolymen är inställd får mikroinjektorns parametrar inte ändras, eftersom detta kommer att påverka volymen. 3) När plasmidblandningen har tagits upp i glaskapillärpipetten ska pipetten hållas ur vägen för att inte råka peta sig själv eller andra. Att använda ett mikropipettstativ (lödhjälpmedel; se materialtabell) som kläms fast på mikroinjektorhållaren är användbart för detta. Men om plasmidblandningen inte injiceras strax efter kommer den sannolikt att täppa till spetsen. Därför är det viktigt att göra en testmikroinjektion på en bit parafilm omedelbart före injektion i hjärnkammaren för att säkerställa att det inte finns någon tilltäppning som blockerar öppningen. Slutligen, i likhet med alla andra kirurgiska tekniker, är utförandet av protokollet olika för varje individ. Det är därför absolut nödvändigt att ha samma tekniker som utför mikroinjektionen och/eller EP för alla grupper av möss i ett experiment.
De hjärntumörmodeller som utvecklats i vårt labb har fokuserat på gliom. Ur ett neurobiologiskt perspektiv är denna metod mellan postnatal dag 0-3 inriktad på gliogenesperioden och perioden postembryonal neurogenes. Intresse för alternativa hjärntumörer kan kräva justering av tidpunkt och/eller position för elektroder. Flera protokoll finns tillgängliga för in utero EP som skulle vara relevanta för neuralbaserade tumörer15,17,18.
Det finns några begränsningar för den här metoden. Möjligheten att klona och blanda och matcha både LOF och GOF DNA-plasmider med hjälp av CRISPR, transposoner och, på senare tid, MADR-systemet gör det möjligt att modellera oändliga kombinationer av patientmutationer. Teknikerna för mikroinjektion och EP är relativt enkla, även om de kräver några övningsförsök för att förbättras och bli konsekventa. En begränsning i den presenterade modellen är hur lång tid det tar för GBM-tumören att utvecklas fullt ut (5 månader). Trots detta arbetar vi för närvarande med ytterligare modeller som använder vanliga tumörmutationer hos patienter som leder till aggressiv tumörtillväxt som varar mindre än 2 månader. Förutom begränsningar är själva utrustningen en betydande initial investering (cirka 20 000-30 000 dollar); Förmågan att elektroporera tiotals om inte hundratals möss i en sittning möjliggör dock en otrolig kraft för ett prekliniskt experiment. Med det sagt, om det finns problem med musuppfödning kan detta bli den största begränsningen, eftersom det är absolut nödvändigt att ha friska uppfödare och friska kullar.
Det har gått flera decennier sedan framsteg inom behandling av hjärntumörer har skett, med den senaste största förbättringen av kemoterapin Temozolomide som förlängde överlevnaden med bara några månader. Immunterapi har revolutionerat många olika cancerformer, men har ännu inte haft någon betydande inverkan på standardbehandlingen inom neuroonkologi. Intressant nog har de modeller av hjärntumörer hos möss som för närvarande används visat stor framgång med immunterapi, men misslyckas kontinuerligt med att översättas till kliniken och visa framgång med patienter. Det är därför absolut nödvändigt att ta ett steg tillbaka och omvärdera de mustumörmodeller som används. Nuvarande modeller bygger på att man använder äldre cellinjer med begränsade mutationer som inte är vanliga hos patienter när man injicerar tusentals celler i hjärnan. Med den teknik som diskuteras i detta protokoll rekapituleras olika tumörmutationsprofiler hos patienter i en musmodell, vilket möjliggör en autokton gradvis utveckling av tumörer inom en tidsram som skulle möjliggöra prekliniska tester på immunkompetenta möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Gi Bum Kim för den immunofluorescerande färgningen och bilderna. Vi tackar också Emily Hatanaka, Naomi Kobritz och Paul Linesch för hjälpsamma råd om protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
