Summary
Este protocolo presenta el establecimiento y la confirmación de un modelo de sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho postnatal en ratones con fístula arteriovenosa abdominal (FAV), que puede aplicarse para investigar cómo la VO contribuye al desarrollo cardíaco postnatal.
Abstract
La sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho (VD) es común en niños con cardiopatías congénitas. En vista de las distintas etapas de desarrollo, el miocardio del VD puede responder de manera diferente a la VO en los niños en comparación con los adultos. El presente estudio tiene como objetivo establecer un modelo postnatal de VO RV en ratones utilizando una fístula arteriovenosa abdominal modificada. Para confirmar la creación de VO y los siguientes cambios morfológicos y hemodinámicos del VD, se realizó ecografía abdominal, ecocardiografía y tinción histoquímica durante 3 meses. Como resultado, el procedimiento en ratones postnatales mostró una supervivencia aceptable y una tasa de éxito de la fístula. En ratones VO, la cavidad del VD se agrandó con una pared libre engrosada y el volumen sistólico aumentó entre un 30% y un 40% dentro de los 2 meses posteriores a la cirugía. A partir de entonces, la presión sistólica del VD aumentó, se observó la correspondiente regurgitación de la válvula pulmonar y apareció una pequeña remodelación de la arteria pulmonar. En conclusión, la cirugía de fístula arteriovenosa modificada (FAV) es factible para establecer el modelo VO del VD en ratones postnatales. Teniendo en cuenta la probabilidad de cierre de la fístula y la resistencia elevada de la arteria pulmonar, se debe realizar una ecografía abdominal y una ecocardiografía para confirmar el estado del modelo antes de la aplicación.
Introduction
La sobrecarga de volumen (VO) del ventrículo derecho (VD) es frecuente en niños con cardiopatías congénitas (CC), lo que conduce a un remodelado miocárdico patológico y a un mal pronóstico a largo plazo 1,2,3. Es esencial una comprensión profunda de la remodelación del VD y las intervenciones tempranas dirigidas relacionadas para obtener un buen resultado en los niños con cardiopatía coronaria. Existen varias diferencias en las estructuras moleculares, las funciones fisiológicas y las respuestas a los estímulos en el corazón de adultos y niños 1,4,5,6. Por ejemplo, bajo la influencia de la sobrecarga de presión, la proliferación de cardiomiocitos es la principal respuesta en los corazones neonatos, mientras que la fibrosis ocurre en los corazones adultos 5,6. Además, muchos fármacos eficaces en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en adultos no tienen ningún efecto terapéutico sobre la insuficiencia cardíaca en niños, e incluso pueden causar más daños 7,8. Por lo tanto, las conclusiones extraídas de los animales adultos no pueden aplicarse directamente a los animales jóvenes.
El modelo de fístula arteriovenosa (FAV) se ha utilizado durante décadas para inducir VO cardíaca crónica y la disfunción cardíaca correspondiente en animales adultos de diferentes especies 9,10,11,12,13. Sin embargo, se sabe poco sobre el modelo en ratones postnatales. En nuestros estudios previos, se generó con éxito un modelo de ratón postnatal VO mediante la creación de una FAV abdominal. También se demostró la alteración de la trayectoria evolutiva del VD en el corazón postnatal14,15,16,17.
Para explorar el proceso quirúrgico modificado subyacente y las características del presente modelo, se presenta un protocolo detallado; El modelo se evalúa durante 3 meses en este estudio.
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Protocol
Todos los procedimientos presentados aquí se ajustaron a los principios descritos en la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal y Estudios Humanos del Centro Médico Infantil de Shanghái (SCMC-LAWEC-2023-003). Para el presente estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6 (P7, machos, 3-4 g). Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón y sus madres lactantes (crías:madres = 6:1 en una sola jaula) se mantuvieron en condiciones de laboratorio libres de patógenos específicos bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 h a 22 ± 2 °C con libre acceso al agua y una dieta nutritiva. Los cachorros fueron asignados aleatoriamente en dos grupos: un grupo VO y un grupo operado de forma simulada (simulado).
1. Preparación de equipos e instrumentos quirúrgicos
NOTA: Los detalles comerciales de todos los materiales/equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Asegúrese de que los siguientes tipos de equipos estén listos y funcionen correctamente: mesa de operaciones (panel de espuma plástica), máquina de anestesia inhalatoria, microscopio con iluminación vertical y cámara incorporada, dispositivo de ultrasonido con transductor de 24 MHz y plataforma de calentamiento termostático.
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos (es decir, un soporte para microagujas, pinzas de punta fina y tijeras de resorte Vannas de mango redondo).
- Ensamble los siguientes consumibles: agujas de sutura quirúrgica 11-0 y 9-0 (punta cónica) con hilo, tiras de cinta adhesiva, agujas de jeringa de 5 ml, seda 2-0 (fijación quirúrgica), hisopos de algodón estériles y gel de ultrasonido.
- Asegúrese de que los siguientes reactivos estén presentes: betadina, etanol al 70%, solución salina estéril normal, isoflurano, paracetamol, ungüento oftálmico y crema depilatoria.
2. Procedimiento quirúrgico
NOTA: El procedimiento de cirugía de fístula fue modificado de acuerdo con el método11 descrito anteriormente. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la operación de FAV en ratones postnatales.
- Anestesia y contención
- Coloque las crías de ratón en una caja de inducción de anestesia suministrada con isoflurano/oxígeno al 2% durante 2 minutos con el flujo ajustado a 1 L/min. Administrar paracetamol (0,1 ml VO de 80 mg/2,5 ml) con una jeringa para la tuberculosis.
- Coloque a los cachorros en decúbito supino sobre la mesa de operaciones con inhalación nasal de isoflurano al 1,5% con un flujo de 0,8 L/min para mantener la anestesia. Ajusta la posición del cachorro atando las patas a las agujas fijas de la jeringa. Aplique ungüento oftálmico en los ojos de los cachorros para prevenir la desecación de la córnea.
- Pellizque la cola del cachorro anestesiado para verificar su capacidad de respuesta al dolor; Ningún movimiento corporal obvio indica una anestesia adecuada.
- Cirugía de fístula
- Desinfecte la piel con tres exfoliantes alternos de betadine y etanol al 70%, y luego cubra el sitio quirúrgico. Corte la pared abdominal y el peritoneo desde la parte inferior del abdomen hasta el subxifoides para exponer completamente la cavidad peritoneal, teniendo cuidado de no lesionar los órganos abdominales. Gotee solución salina estéril normal para humedecer los órganos externalizados.
- Tire suavemente del tracto gastrointestinal y la vejiga lejos del sitio quirúrgico con hisopos de algodón para visualizar la aorta abdominal vertical (AA) y la vena cava inferior (IVC) debajo del retroperitoneo. Gire la mesa de operaciones 90° en sentido contrario a las agujas del reloj y ajuste el aumento del microscopio para visualizar claramente los dos recipientes horizontales.
- Punción de la fístula desde el AA en la VCI en dirección oblicua 1 cm distal a la arteria renal con una aguja de sutura 11-0 (diámetro = 0,07 mm). Verificar la creación exitosa de la fístula en función de la hinchazón y la mezcla de sangre venosa y arterial en la VCI.
- A continuación, comprima rápidamente el punto de sangrado con una fuerza adecuada aplicada con bastoncillos de algodón secos durante 15 s. Reemplace el estómago, los intestinos y la vejiga en la cavidad abdominal lo antes posible para promover la compresión hemostática.
- Suturar la pared abdominal y el peritoneo con una sutura de manta utilizando un hilo de sutura 9-0. Suspenda la anestesia y proporcione a los cachorros oxígeno al 100% durante 1 minuto.
- Reanimación con anestesia
- Coloque a los cachorros en una plataforma de calentamiento a 38 °C. Después de un despertar completo con vitalidad, devuelva a los cachorros a su madre lactante. Todo el procedimiento dura aproximadamente 15 min.
NOTA: En el presente estudio, el grupo simulado se somete al mismo procedimiento, excepto por la etapa de punción.
- Coloque a los cachorros en una plataforma de calentamiento a 38 °C. Después de un despertar completo con vitalidad, devuelva a los cachorros a su madre lactante. Todo el procedimiento dura aproximadamente 15 min.
3. Confirmación ecográfica de fístula
NOTA: El funcionamiento general del ecógrafo fue idéntico al de los informes anteriores18,19.
- Confirmación de fístula mediante ecografía abdominal
- Después de la inducción de la anestesia (paso 2.1.1), fije los ratones con tiras de cinta adhesiva en posición supina sobre la plataforma caliente. Luego, conecte los ratones a un monitor de electrocardiograma (ECG) con gel de ultrasonido. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% a un flujo de 0,8 L/min.
- Prepara la piel del pecho y el abdomen con crema depilatoria. Después de unos segundos, retire la crema con una punta de algodón empapada en agua tibia. Coloque el transductor (24 MHz) en la línea abdominal media y gire el marcador del transductor hacia la cabeza de los ratones.
- Mueva la plataforma hacia abajo hacia el lado izquierdo o derecho de los ratones y use el modo B y el modo Doppler color para visualizar la vista del eje largo de los vasos y las señales sanguíneas18,19. Mida la velocidad del flujo sanguíneo del AA, la VCI y la fístula para confirmar la permeabilidad de la FAV a través del modo Doppler de onda pulsada.
NOTA: La creación exitosa de la fístula en la ecografía fue indicada por una señal de flujo turbulento visible entre el AA y la VCI (Figura 2C). La velocidad del flujo sanguíneo Doppler en el sitio de la FAV fue significativamente elevada en comparación con una velocidad sistólica relativamente más baja en el AA (Figura 2A, C). Además, en contraste con los patrones de flujo normales en la VCI (Figura 2B), la forma de onda pulsátil del flujo sanguíneo de la VCI proximal a la FAV también confirmó la creación exitosa de la fístula (Figura 2D).
- Confirmación de VO por ecocardiografía
- Mueva la parte del extremo de la cola de la plataforma hacia abajo, coloque el transductor (24 MHz) en el pecho y gire el marcador del transductor hacia el hombro derecho de los ratones. Visualice la vista paraesternal modificada del eje largo de la arteria pulmonar (AP) utilizando el modo B y el modo Doppler color.
- Usando el modo Doppler de onda pulsada, mida las señales de flujo sanguíneo en la PA, incluida la integral de tiempo de velocidad (PA-VTI), el diámetro de la válvula PA (PAD), el tiempo de aceleración arterial pulmonar (PAT) y el tiempo de eyección del VD (RVET) (Figura 2E, F y Figura 3A, B).
- Mida los parámetros de ultrasonido a partir de la media de tres mediciones consecutivas. Calcule el volumen sistólico del VD (RVSV, ml) y la presión sistólica del VD (RVSP, mmHg) utilizando las siguientes fórmulas20:
RVSV [mL] = 1/4 × πD2 × VTIPA
RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - índice + 63.7
NOTA: Teniendo en cuenta el sesgo de medición ecográfica, se consideró un aumento del >15% en la RVSV o VTIPA en ratones VO en comparación con los ratones del grupo simulado en el RV (Figura 2E, F).
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Representative Results
Tasa de supervivencia y permeabilidad de la FAV a los 3 meses
Un total de 30 (75%) ratones en el grupo VO y 19 (95%) ratones en el grupo simulado sobrevivieron a la cirugía de FAV (Figura 4A). En el grupo de VO, ocho ratones murieron dentro de 1 día después de la cirugía debido a sangrado excesivo (n = 5) o canibalización (n = 3), mientras que dos ratones murieron por causas desconocidas al mes de edad.
De los ratones VO supervivientes (n = 30), la ecografía confirmó el establecimiento exitoso de fístulas en 21 ratones en el postoperatorio, que se demostró que eran permeables a la 1 semana del postoperatorio (P14) y se mantuvieron hasta 2 semanas después del postoperatorio (P21). Sin embargo, la fístula se cerró a 1 mes en siete ratones y a los 2 meses en dos ratones. Solo 12 ratones tenían una FAV persistente a los 3 meses de seguimiento. Las tasas de permeabilidad de la FAV fueron del 70, 70, 46,7 y 40% a la 1 semana, 2 semanas, 1 mes y 2 meses después de la operación, respectivamente (Figura 4B).
Cambios hemodinámicos en el corazón derecho
El seguimiento a los 3 meses de los parámetros hemodinámicos mostró que tanto la EAP como el RVSV de los ratones de cada grupo aumentaron con la edad en dos meses (n = 6 en ambos grupos; Figura 3B, E, F). En comparación con los ratones operados simuladamente, la PA-VTI fue significativamente mayor en el grupo de VO dentro de las 2 semanas posteriores a la operación (Figura 3D), pero disminuyó a partir de entonces, y los patrones de flujo de PA cambiaron con la disminución de la PAT (Figura 3A). El RVSV en el grupo de VO fue consistentemente más alto que el del grupo simulado durante 2 meses, con un aumento de aproximadamente 30%-40%. La RVSP aumentó significativamente con la regurgitación pulmonar 2 meses después de la cirugía (Figura 3C,G).
Cambios morfológicos en el corazón derecho y en las arterias pulmonares pequeñas
Bajo el microscopio, el VD se agrandó significativamente en comparación con el grupo simulado después de la FAV (Figura 5A). La tinción histológica mostró un engrosamiento de la pared libre de RV y un agrandamiento de la cavidad del VD en los ratones VO (Figura 5B). De acuerdo con los cambios hemodinámicos del VD, el RVSP se elevó 2 meses después de la cirugía. Los tejidos pulmonares de dos grupos de ratones 3 meses después de la cirugía se seleccionaron aleatoriamente para la tinción de hematoxilina y eosina (HE), que mostraron un engrosamiento de la túnica media, hiperplasia endotelial e infiltración de células inflamatorias periféricas en algunas de las pequeñas arterias pulmonares del grupo VO (Figura 5C).
Figura 1: Diagrama esquemático de la operación de FAV en ratones postnatales . (A) Instrumentos quirúrgicos. (B) El procedimiento de la cirugía de FAV. Abreviaturas: FAV = fístula arteriovenosa; VCI = vena cava inferior; AA = aorta abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confirmación de fístula de FAV y VO por ecografía. (A) Señal de flujo pulsátil normal en el AA (velocidad máxima de flujo: 400 mm/s). (B) Señal de flujo sanguíneo normal de la VCI. (C) Aumento de la velocidad del flujo en la fístula (la señal roja de flujo sanguíneo con un tono amarillo y verde en el interior indicaba una señal de flujo turbulento en la fístula; velocidad máxima del flujo sistólico: 900 mm/s). (D) Flujo pulsátil en la VCI cerca de la fístula con el aumento de la velocidad del flujo. (E) Aumento de PA-VTI en ratones VO 1 semana después de la cirugía. (F) PA-VTI en ratones simulados 1 semana después de la cirugía (la señal de flujo sanguíneo azul indicaba el flujo sanguíneo del PA). Abreviaturas: FAV = fístula arteriovenosa; VCI = vena cava inferior; AA = aorta abdominal; PA = arteria pulmonar; VTI = integral velocidad-tiempo. En el modo de color Doppler, el flujo hacia el transductor se codificaba en rojo y el alejamiento del transductor se codificaba en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones hemodinámicas del corazón derecho derivadas de la ecocardiografía. (A) Los patrones de flujo Doppler en cada punto de tiempo de los ratones VO mostraron una disminución gradual de la PAT. (B) Mediciones bidimensionales de los parámetros de PA. (C) Regurgitación de PA en ecocardiografía Doppler color. (D-F) Cambios en PA-VTI, PAD y RVSV en cada momento en ratones VO postoperatorios. (G) El histograma de RVSP en ratones VO (negros) y simulados (grises) mostró un aumento de RVSP en 2 meses y 3 meses después de la cirugía de FAV (seis ratones VO; seis ratones simulados; Prueba t de Student; *representa significación estadística). Abreviaturas: P14 = día postnatal 14; P21 = día postnatal 21; RVP = regurgitación de la válvula pulmonar; RVSP = presión sistólica del ventrículo derecho; M = meses; W = semanas. La figura F es una adaptación de Sun et al. con permiso14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tasa de supervivencia y tasa de permeabilidad de la fístula de ratones después de la cirugía de FAV. (A) La tasa de supervivencia de los ratones postnatales después de la cirugía (n = 40 en el grupo VO; n = 20 en el grupo simulado). (B) Tasa de permeabilidad de la fístula en ratones VO (n = 30). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cambios morfológicos en el corazón derecho . (A) Agrandamiento del corazón en ratones VO en cada momento después de la cirugía de FAV. (B) La tinción de HE cardíaca en diferentes momentos después de la cirugía mostró un engrosamiento de la pared libre de VD y una cavidad VD agrandada. (C) Los cambios histopatológicos de las arteriolas pulmonares en ratones después de la FAV mostraron hiperplasia e hipertrofia de las arterias pulmonares pequeñas con infiltración de células inflamatorias. Barras de escala: (A) = 5 mm; (B) = 2000 μm; (C) = 50 μm. Abreviaturas: W = semanas; M = meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Anteriormente, el modelo clásico de RV VO se creaba utilizando la regurgitación valvular21; sin embargo, en comparación con la FAV, la cirugía de válvula a corazón abierto puede requerir técnicas más sofisticadas y puede estar asociada con una mortalidad significativamente mayor, particularmente en ratones posnatales. Como los estudios en animales han demostrado que el mismo efecto de la VO se ha logrado con la FAV22, en este estudio se utilizó la cirugía de fístula abdominal modificada con menos traumatismo.
Durante el procedimiento se tuvieron en cuenta ciertos factores para establecer con éxito la fístula. En primer lugar, el procedimiento se llevó a cabo en ratones postnatales sin intubación endotraqueal ni ventilación asistida; Por lo tanto, el ajuste oportuno de la configuración de la anestesia para los cachorros de acuerdo con su condición dinámica fue esencial para evitar la muerte por insuficiencia respiratoria. En segundo lugar, el estómago y la vejiga del cachorro estaban con frecuencia en un estado completo durante la cirugía. Por lo tanto, para exponer adecuadamente las estructuras vasculares retroperitoneales, se necesitó una operación suave y delicada para evitar lesiones en los frágiles órganos abdominales. En tercer lugar, la ligadura del AA para prevenir hemorragias arteriales graves fue difícil de realizar en las crías; por lo tanto, se requirió compresión hemostática con hisopos de algodón inmediatamente después de la punción. A partir de entonces, fue posible que el retroperitoneo y los órganos abdominales produjeran una mayor compresión en el sitio de la hemorragia. Además, se observó que una compresión excesiva puede contribuir al fracaso precoz de la fístula.
Debido al procedimiento menos traumático en comparación con los modelos VO VO adultos, los ratones VO postnatales mostraron una supervivencia perioperatoria relativamente más alta, pero menores tasas de éxito de la fístula en el período postoperatorio temprano11,23. Además de la hemorragia severa, la canibalización de la madre inexperta fue la principal causa de muerte en los cachorros después de la cirugía. Un ambiente de reproducción cómodo y tranquilo, el cierre hermético de las heridas abdominales, la rápida recuperación de la temperatura corporal y el despertar completo de las crías después de la anestesia pueden reducir el riesgo de canibalización. Estudios previos en modelos de ratón adultos de FAV han encontrado que la formación de FAV tiene tres etapas: período de trombosis rápida en los días postoperatorios 0-1, período de madurez de la fístula durante 3 semanas y, finalmente, creación exitosa de FAV con recierre de fístula en algunos ratones en 3-6 semanas23. En este estudio, la curva de permeabilidad de la fístula de los ratones postnatales también mostró la misma trayectoria (es decir, el cierre de la fístula se produjo principalmente dentro de 1 semana o durante 4-8 semanas después de la cirugía, y las fístulas restantes permanecieron abiertas a los 3 meses). Por lo tanto, es fundamental confirmar la permeabilidad de la fístula en los ratones FAV postnatales dentro de los 2 meses posteriores a la cirugía mediante ecografía abdominal.
Un aumento del RVSV es otra prueba esencial de la VO del RV, excepto por la permeabilidad de la fístula. En la actualidad, el cateterismo cardíaco es difícil de implementar en ratones jóvenes de bajo peso. Beneficiándose de las ventajas de su carácter no invasivo, de su manipulación relativamente sencilla y de la monitorización continua del mismo ratón, se aplicó la ecocardiografía con transductores de alta frecuencia para evaluar los cambios hemodinámicos en este estudio. El RVSV se estimó mediante el VTI del flujo sanguíneo pulmonar, y aumentó entre un 30% y un 40% en los 2 meses posteriores a la cirugía en los ratones VO posnatales. Estos resultados demostraron aún más el establecimiento exitoso de la FAV y la VO RV en este modelo.
La VO crónica puede conducir gradualmente a una resistencia pulmonar funcionalmente elevada y, finalmente, a la remodelación vascular de las arteriolas PA. Este proceso es común en niños con cardiopatía coronaria con una derivación de izquierda a derecha. Estudios previos en animales en ovejas y lechones han demostrado que la FAV podría conducir a cambios estructurales y funcionales en el sistema vascular pulmonar 13,24,25. Durante el seguimiento posterior a los 2 meses después de la cirugía, se observaron patrones morfológicos anormales del flujo Doppler de PA con disminución de la PAT, insuficiencia de la válvula pulmonar y una tendencia a la baja del RVSV en ratones VO. Como se informó anteriormente, el PAT se puede utilizar como un parámetro complementario para evaluar la poscarga del VD en neonatos y niños. Los fenómenos mencionados anteriormente pueden sugerir una alteración de la resistencia vascular pulmonar en los ratones VO26,27,28. Para cuantificar la elevada poscarga o sobrecarga de presión del VD, se utilizó el cociente de PAT y RVET para estimar el valor de RVSP utilizando la fórmula verificada por Thibault en ratón adulto18, que demostró que RVSP aumentó significativamente 2 meses después de la cirugía de FAV en el modelo postnatal. Además, la evidencia histopatológica de inflamación y remodelación de PA en varios lóbulos pulmonares de ratones VO demostró aún más las anomalías estructurales 3 meses después de la cirugía. Por lo tanto, para excluir el efecto de la sobrecarga de presión, se sugirió que la aplicación de este modelo VO RV de ratones postnatales se limitara a 2 meses después de la cirugía.
En resumen, la cirugía de FAV modificada es una técnica factible para establecer el modelo VO RV en ratones postnatales. Teniendo en cuenta la probabilidad de cierre de la fístula y la resistencia elevada de la arteria pulmonar, se debe realizar una ecografía abdominal y una ecocardiografía para confirmar el estado del modelo antes de la aplicación.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias de China (n.º 82200309) y el Proyecto de Innovación del Equipo Médico Distinguido de Ningbo (n.º 2022020405)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Tiandz,Chia | ||
| ACETAMINOPHEN Oral Solution | VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA | NDC 66689-054-01 | |
| Anesthesia machine | RWD Life Science,China | R550IP | |
| Anesthesia mask | RWD Life Science,China | 68680 | |
| C57BL/6 mice | Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China) | ||
| Hair removal cream | Veet, France | VT-200 | |
| Hematoxylin and eosin Kit | Beyotime biotech | C0105M | |
| Isoflurane | RWD Life Science,China | R510-22-10 | |
| Microscope | Yuyan Instruments, China | SM-301 | |
| Surgical suture needles | NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China | ||
| Thermostatic heating platform | Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China | ||
| Ultrasound device | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories,United States | REF 01-08 | |
| Ultrasound transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS 400 |
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