Summary
Questo protocollo presenta la creazione e la conferma di un modello postnatale di sovraccarico del volume ventricolare destro (VO) in topi con fistola arterovenosa addominale (AVF), che può essere applicato per studiare come il VO contribuisce allo sviluppo cardiaco postnatale.
Abstract
Il sovraccarico di volume (VO) del ventricolo destro (RV) è comune nei bambini con cardiopatia congenita. In considerazione delle diverse fasi di sviluppo, il miocardio del ventricolo destro può rispondere in modo diverso al VO nei bambini rispetto agli adulti. Il presente studio mira a stabilire un modello postnatale di RV VO nei topi utilizzando una fistola arterovenosa addominale modificata. Per confermare la creazione del VO e le successive alterazioni morfologiche ed emodinamiche del ventricolo destro, sono stati eseguiti per 3 mesi l'ecografia addominale, l'ecocardiografia e la colorazione istochimica. Di conseguenza, la procedura nei topi postnatali ha mostrato un tasso di sopravvivenza e di successo della fistola accettabile. Nei topi VO, la cavità del ventricolo destro è stata ampliata con una parete libera ispessita e il volume sistolico è aumentato di circa il 30%-40% entro 2 mesi dall'intervento chirurgico. Successivamente, la pressione sistolica del ventricolo destro è aumentata, è stato osservato un corrispondente rigurgito della valvola polmonare ed è apparso un rimodellamento della piccola arteria polmonare. In conclusione, la chirurgia della fistola arterovenosa modificata (AVF) è fattibile per stabilire il modello RV VO nei topi postnatali. Considerando la probabilità di chiusura della fistola e l'elevata resistenza dell'arteria polmonare, è necessario eseguire un'ecografia addominale e un'ecocardiografia per confermare lo stato del modello prima dell'applicazione.
Introduction
Il sovraccarico di volume (VO) del ventricolo destro (RV) è comune nei bambini con cardiopatia congenita (CHD), che porta a un rimodellamento miocardico patologico e a una prognosi sfavorevole a lungo termine 1,2,3. Una comprensione approfondita del rimodellamento del ventricolo destro e dei relativi interventi mirati precoci è essenziale per un buon risultato nei bambini con CHD. Ci sono diverse differenze nelle strutture molecolari, nelle funzioni fisiologiche e nelle risposte agli stimoli nel cuore di adulti e bambini 1,4,5,6. Ad esempio, sotto l'influenza del sovraccarico di pressione, la proliferazione dei cardiomiociti è la risposta principale nei cuori neonatali, mentre la fibrosi si verifica nei cuori adulti 5,6. Inoltre, molti farmaci efficaci nel trattamento dell'insufficienza cardiaca negli adulti non hanno alcun effetto terapeutico sull'insufficienza cardiaca nei bambini e possono persino causare ulteriori danni 7,8. Pertanto, le conclusioni tratte dagli animali adulti non possono essere applicate direttamente agli animali giovani.
Il modello di fistola arterovenosa (AVF) è stato utilizzato per decenni per indurre il VO cardiaco cronico e la corrispondente disfunzione cardiaca in animali adulti di diverse specie 9,10,11,12,13. Tuttavia, si sa poco del modello nei topi postnatali. Nei nostri studi precedenti, un modello murino postnatale VO è stato generato con successo dalla creazione di una FAV addominale. È stato dimostrato anche il cambiamento del percorso di sviluppo del ventricolo destro nel cuore postnatale14,15,16,17.
Per esplorare il processo chirurgico modificato sottostante e le caratteristiche del presente modello, viene presentato un protocollo dettagliato; Il modello viene valutato per 3 mesi in questo studio.
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Protocol
Tutte le procedure qui presentate sono conformi ai principi delineati nella Dichiarazione di Helsinki e sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali e gli studi umani presso lo Shanghai Children's Medical Center (SCMC-LAWEC-2023-003). Per il presente studio sono stati utilizzati cuccioli di topo C57BL/6 (P7, maschi, 3-4 g). Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I cuccioli di topo e le loro madri che allattano (cuccioli:madri = 6:1 in una singola gabbia) sono stati tenuti in condizioni di laboratorio prive di agenti patogeni specifici in un ciclo di luce e buio di 12 ore a 22 ± 2 °C con libero accesso all'acqua e una dieta nutrizionale. I cuccioli sono stati randomizzati in due gruppi: un gruppo VO e un gruppo operato fittiziamente.
1. Preparazione dell'attrezzatura e degli strumenti chirurgici
NOTA: I dettagli commerciali di tutti i materiali/attrezzature sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Assicurarsi che i seguenti tipi di apparecchiature siano pronti e correttamente funzionanti: tavolo operatorio (pannello in plastica espansa), macchina per anestesia inalatoria, microscopio con illuminazione verticale e telecamera incorporata, dispositivo a ultrasuoni con trasduttore a 24 MHz e piattaforma di riscaldamento termostatico.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (ad esempio, un porta-aghi, una pinza a punta fine e forbici a molla Vannas a manico rotondo).
- Assemblare i seguenti materiali di consumo: aghi da sutura chirurgici 11-0 e 9-0 (punta conica) con filo, strisce di nastro, aghi per siringa da 5 ml, seta 2-0 (fissaggio chirurgico), cotton fioc sterili e gel per ultrasuoni.
- Assicurarsi che siano presenti i seguenti reagenti: betadina, etanolo al 70%, soluzione salina sterile normale, isoflurano, paracetamolo, unguento oftalmico e crema depilatoria.
2. Procedura chirurgica
NOTA: La procedura chirurgica della fistola è stata modificata secondo il metodo11 precedentemente descritto. La Figura 1 mostra un diagramma schematico dell'operazione AVF nei topi postnatali.
- Anestesia e contenzione
- Mettere i cuccioli di topo in una scatola di induzione per anestesia alimentata con isoflurano/ossigeno al 2% per 2 minuti con il flusso impostato su 1 L/min. Somministrare paracetamolo (0,1 ml PO da 80 mg/2,5 ml) utilizzando una siringa per la tubercolosi.
- Posizionare i cuccioli in posizione supina sul tavolo operatorio con inalazione nasale di isoflurano all'1,5% con un flusso di 0,8 L/min per mantenere l'anestesia. Regola la posizione del cucciolo legando le zampe agli aghi fissi della siringa. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei cuccioli per prevenire l'essiccazione corneale.
- Pizzica la coda del cucciolo anestetizzato per verificarne la reattività al dolore; Nessun movimento evidente del corpo indica un'anestesia adeguata.
- Chirurgia della fistola
- Disinfettare la pelle con tre scrub alternati di betadine ed etanolo al 70%, quindi drappeggiare il sito chirurgico. Tagliare la parete addominale e il peritoneo dal basso addome al subxifoide per esporre completamente la cavità peritoneale, facendo attenzione a non ferire gli organi addominali. Gocciolare una normale soluzione fisiologica sterile per inumidire gli organi esternalizzati.
- Allontanare delicatamente il tratto gastrointestinale e la vescica dal sito chirurgico utilizzando tamponi di cotone per visualizzare l'aorta addominale verticale (AA) e la vena cava inferiore (IVC) sotto il retroperitoneo. Ruotare il tavolo operatorio di 90° in senso antiorario e regolare l'ingrandimento del microscopio per visualizzare chiaramente i due recipienti orizzontali.
- Perforare la fistola dall'AA all'IVC in direzione obliqua di 1 cm distale rispetto all'arteria renale con un ago di sutura 11-0 (diametro = 0,07 mm). Verificare la corretta creazione della fistola in base al gonfiore e alla miscelazione del sangue venoso e arterioso nell'IVC.
- Successivamente, comprimere rapidamente il punto di sanguinamento utilizzando una forza appropriata applicata con tamponi di cotone asciutti per 15 s. Sostituire lo stomaco, l'intestino e la vescica nella cavità addominale il prima possibile per favorire la compressione emostatica.
- Suturare la parete addominale e il peritoneo con un punto a cavallo utilizzando un filo di sutura 9-0. Interrompere l'anestesia e fornire ai cuccioli il 100% di ossigeno per 1 minuto.
- Rianimazione in anestesia
- Posizionare i cuccioli su una piattaforma riscaldante a 38 °C. Dopo un completo risveglio con vitalità, restituisci i cuccioli alla madre che allatta. L'intera procedura dura circa 15 minuti.
NOTA: Nel presente studio, il gruppo fittizio viene sottoposto alla stessa procedura ad eccezione della fase di puntura.
- Posizionare i cuccioli su una piattaforma riscaldante a 38 °C. Dopo un completo risveglio con vitalità, restituisci i cuccioli alla madre che allatta. L'intera procedura dura circa 15 minuti.
3. Conferma ecografica della fistola
NOTA: Il funzionamento generale dell'ecografo era identico ai rapporti precedenti18,19.
- Conferma della fistola mediante ecografia addominale
- Dopo l'induzione dell'anestesia (passaggio 2.1.1), fissare i topi con strisce di nastro adesivo in posizione supina sulla piattaforma calda. Quindi, collegare i topi a un monitor per elettrocardiogramma (ECG) con gel per ultrasuoni. Mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano all'1,5% con un flusso di 0,8 L/min.
- Preparare la pelle del torace e dell'addome utilizzando una crema depilatoria. Dopo qualche secondo, rimuovere la crema con una punta di cotone imbevuta di acqua tiepida. Posizionare il trasduttore (24 MHz) sulla linea addominale e ruotare il marcatore del trasduttore sulla testa dei topi.
- Spostare la piattaforma verso il basso sul lato sinistro o destro dei topi e utilizzare la modalità B e la modalità Color Doppler per visualizzare la vista sull'asse lungo dei vasi e dei segnali ematici18,19. Misurare la velocità del flusso sanguigno dell'AA, dell'IVC e della fistola per confermare la pervietà dell'AVF attraverso la modalità Doppler a onde pulsate.
NOTA: La corretta creazione di fistole sull'ecografia è stata indicata da un segnale di flusso turbolento visibile tra l'AA e l'IVC (Figura 2C). La velocità del flusso sanguigno Doppler nel sito AVF era significativamente elevata rispetto a una velocità sistolica relativamente più bassa nell'AA (Figura 2A,C). Inoltre, in contrasto con i normali modelli di flusso nell'IVC (Figura 2B), anche la forma d'onda pulsatile del flusso sanguigno IVC prossimale all'AVF ha confermato il successo della creazione della fistola (Figura 2D).
- Conferma del VO mediante ecocardiografia
- Spostare la parte posteriore della piattaforma verso il basso, posizionare il trasduttore (24 MHz) sul petto e ruotare il marcatore del trasduttore sulla spalla destra dei topi. Visualizza la vista parasternale modificata dell'asse lungo dell'arteria polmonare (PA) utilizzando la modalità B e la modalità color Doppler.
- Utilizzando la modalità Doppler a onde pulsate, misurare i segnali del flusso sanguigno nel PA, tra cui l'integrale del tempo di velocità (PA-VTI), il diametro della valvola PA (PAD), il tempo di accelerazione arteriosa polmonare (PAT) e il tempo di eiezione del ventricolo destro (RVET) (Figura 2E,F e Figura 3A,B).
- Misurare i parametri ecografici dalla media di tre misurazioni consecutive. Calcolare la gittata sistolica del ventricolo destro (RVSV, mL) e la pressione sistolica del ventricolo destro (RVSP, mmHg) utilizzando le seguenti formule20:
RVSV [mL] =1/4 × πD2 × VTIPA
RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - indice + 63,7
NOTA: Considerando la distorsione della misurazione ecografica, un aumento del >15% nelPA RVSV o VTI nei topi VO rispetto ai topi nel gruppo sham è stato considerato VO nel gruppo RV (Figura 2E,F).
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Representative Results
Tasso di sopravvivenza e pervietà AVF entro 3 mesi
Un totale di 30 (75%) topi nel gruppo VO e 19 (95%) topi nel gruppo sham sono sopravvissuti all'intervento chirurgico AVF (Figura 4A). Nel gruppo VO, otto topi sono morti entro 1 giorno dall'intervento chirurgico a causa di sanguinamento eccessivo (n = 5) o cannibalizzazione (n = 3), mentre due topi sono morti per cause sconosciute a 1 mese.
Dei topi VO sopravvissuti (n = 30), l'ecografia ha confermato l'instaurazione di fistole in 21 topi dopo l'intervento, che si sono dimostrate pervie a 1 settimana postoperatoria (P14) e mantenute fino a 2 settimane dopo l'intervento (P21). Tuttavia, la fistola si è chiusa a 1 mese in sette topi e a 2 mesi in due topi. Solo 12 topi hanno avuto una FAV persistente al follow-up di 3 mesi. I tassi di pervietà della FAV sono stati rispettivamente del 70, 70, 46,7 e 40% a 1, 2 settimane, 1 mese e 2 mesi dopo l'intervento (Figura 4B).
Cambiamenti emodinamici nel cuore destro
Il follow-up di 3 mesi dei parametri emodinamici ha mostrato che sia la PAD che la RVSV dei topi di ciascun gruppo aumentavano con l'età entro due mesi (n = 6 in entrambi i gruppi; Figura 3B,E,F). Rispetto ai topi operati fittizi, il PA-VTI era significativamente più alto nel gruppo VO entro 2 settimane dall'intervento (Figura 3D), ma è diminuito in seguito e i modelli di flusso PA sono cambiati con la diminuzione del PAT (Figura 3A). L'RVSV nel gruppo VO è stato costantemente superiore a quello nel gruppo sham per 2 mesi, con un aumento di circa il 30%-40%. La RVSP è risultata significativamente aumentata con rigurgito polmonare 2 mesi dopo l'intervento chirurgico (Figura 3C,G).
Alterazioni morfologiche del cuore destro e delle piccole arterie polmonari
Al microscopio, il ventricolo destro era significativamente ingrandito rispetto al gruppo fittizio dopo l'AVF (Figura 5A). La colorazione istologica ha mostrato un ispessimento della parete priva di RV e una cavità del ventricolo destro allargata nei topi VO (Figura 5B). Secondo i cambiamenti emodinamici del ventricolo destro, il RVSP era elevato 2 mesi dopo l'intervento chirurgico. I tessuti polmonari di due gruppi di topi 3 mesi dopo l'intervento chirurgico sono stati selezionati in modo casuale per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE), che ha mostrato un ispessimento della tunica media, iperplasia endoteliale e infiltrazione di cellule infiammatorie periferiche in alcune delle piccole arterie polmonari del gruppo VO (Figura 5C).
Figura 1: Diagramma schematico dell'operazione di AVF nei topi postnatali . (A) Strumenti chirurgici. (B) La procedura di chirurgia AVF. Abbreviazioni: AVF = fistola arterovenosa; IVC = vena cava inferiore; AA = aorta addominale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conferma della fistola AVF e dell'VO mediante ecografia. (A) Segnale di flusso pulsatile normale nell'AA (velocità di flusso di picco: 400 mm/s). (B) Normale segnale del flusso sanguigno dell'IVC. (C) Aumento della velocità del flusso alla fistola (il segnale rosso del flusso sanguigno con una tonalità gialla e verde all'interno indicava un segnale di flusso turbolento alla fistola; velocità del flusso sistolico di picco: 900 mm/s). (D) Flusso pulsatile nell'IVC vicino alla fistola con l'aumento della velocità del flusso. (E) Aumento di PA-VTI nei topi VO 1 settimana dopo l'intervento chirurgico. (F) PA-VTI in topi fittizi 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (il segnale blu del flusso sanguigno indicava il flusso sanguigno del PA). Abbreviazioni: AVF = fistola arterovenosa; IVC = vena cava inferiore; AA = aorta addominale; PA = arteria polmonare; VTI = integrale velocità-tempo. In modalità colore Doppler, il flusso verso il trasduttore è stato codificato in rosso e lontano dal trasduttore è stato codificato in blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazioni emodinamiche del cuore destro derivate dall'ecocardiografia. (A) I modelli di flusso Doppler in ogni punto temporale dei topi VO hanno mostrato una graduale diminuzione della PAT. (B) Misure bidimensionali dei parametri PA. (C) Rigurgito PA all'ecocardiografia color Doppler. (D-F) Cambiamenti in PA-VTI, PAD e RVSV in ogni momento nei topi VO postoperatori. (G) L'istogramma di RVSP nei topi VO (neri) e sham (grigi) ha mostrato un aumento di RVSP in 2 mesi e 3 mesi dopo l'intervento chirurgico di AVF (sei topi VO; sei topi fittizi; Test t dello studente; *rappresenta la significatività statistica). Abbreviazioni: P14 = giorno postnatale 14; P21 = giorno postnatale 21; PVR = rigurgito valvolare polmonare; RVSP = pressione sistolica ventricolare destra; M = mesi; W = settimane. La figura F è adattata da Sun et al. con il permesso14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tasso di sopravvivenza e tasso di pervietà della fistola dei topi dopo l'intervento chirurgico di FAV. (A) Il tasso di sopravvivenza dei topi postnatali dopo l'intervento chirurgico (n = 40 nel gruppo VO; n = 20 nel gruppo sham). (B) Tasso di pervietà della fistola nei topi VO (n = 30). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cambiamenti morfologici nel cuore destro . (A) Cuore ingrandito nei topi VO in ogni punto temporale dopo l'intervento chirurgico di FAV. (B) La colorazione cardiaca dell'HE in diversi momenti dopo l'intervento chirurgico ha mostrato una parete priva di RV ispessita e una cavità RV allargata. (C) Cambiamenti istopatologici delle arteriole polmonari nei topi dopo AVF hanno mostrato iperplasia e ipertrofia delle piccole arterie polmonari con infiltrazione di cellule infiammatorie. Barre graduate: (A) = 5 mm; (B) = 2000 μm; (C) = 50 μm. Abbreviazioni: W = settimane; M = mesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In precedenza, il classico modello RV VO veniva creato utilizzando il rigurgito della valvola21; tuttavia, rispetto alla FAV, la chirurgia della valvola a cuore aperto può richiedere tecniche più sofisticate e può essere associata a una mortalità significativamente più elevata, in particolare nei topi postnatali. Poiché gli studi sugli animali hanno dimostrato che lo stesso effetto del VO è stato ottenuto dall'AVF22, in questo studio è stata utilizzata la chirurgia della fistola addominale modificata con meno traumi.
Alcuni fattori sono stati presi in considerazione durante la procedura per stabilire con successo la fistola. In primo luogo, la procedura è stata condotta in topi postnatali senza intubazione endotracheale e ventilazione assistita; Pertanto, la regolazione tempestiva delle impostazioni di anestesia per i cuccioli in base alle loro condizioni dinamiche era essenziale per evitare la morte per insufficienza respiratoria. In secondo luogo, lo stomaco e la vescica del cucciolo erano spesso in uno stato completo durante l'intervento chirurgico. Pertanto, per esporre adeguatamente le strutture vascolari retroperitoneali, è stato necessario un intervento delicato e delicato per evitare lesioni ai fragili organi addominali. In terzo luogo, la legatura dell'AA per prevenire gravi emorragie arteriose era difficile da eseguire nei cuccioli; Pertanto, è stata necessaria la compressione emostatica con tamponi di cotone subito dopo la puntura. Successivamente, è stato possibile per il retroperitoneo e gli organi addominali produrre un'ulteriore compressione sul sito di sanguinamento. Inoltre, è stato notato che una compressione eccessiva può contribuire all'insufficienza precoce della fistola.
A causa della procedura meno traumatica rispetto ai modelli adulti di RV VO, i topi VO postnatali hanno mostrato una sopravvivenza perioperatoria relativamente più elevata ma tassi di successo della fistola più bassi nel primo periodo postoperatorio11,23. Oltre alla grave emorragia, la cannibalizzazione della madre inesperta è stata la principale causa di morte nei cuccioli dopo l'intervento chirurgico. Un ambiente di allevamento confortevole e tranquillo, una chiusura ermetica delle ferite addominali, un rapido recupero della temperatura corporea e il risveglio completo dei cuccioli dopo l'anestesia possono ridurre il rischio di cannibalizzazione. Precedenti studi su modelli murini adulti di AVF hanno rilevato che la formazione di AVF ha tre fasi: periodo di trombosi rapida nei giorni postoperatori 0-1, periodo di maturità della fistola per 3 settimane e infine creazione di AVF con richiusura della fistola in alcuni topi in 3-6 settimane23. In questo studio, anche la curva di pervietà della fistola dei topi postnatali ha mostrato la stessa traiettoria (cioè, la chiusura della fistola si è verificata principalmente entro 1 settimana o durante 4-8 settimane dopo l'intervento chirurgico e le fistole rimanenti sono rimaste aperte a 3 mesi). Pertanto, è fondamentale confermare la pervietà della fistola nei topi AVF postnatali entro 2 mesi dall'intervento chirurgico mediante ecografia addominale.
Un aumento del RVSV è un'altra prova essenziale per RV VO, ad eccezione della pervietà della fistola. Attualmente, il cateterismo cardiaco è difficile da implementare nei topi giovani e di basso peso. Beneficiando dei vantaggi della sua non invasività, della manipolazione relativamente semplice e del monitoraggio continuo dello stesso topo, l'ecocardiografia con trasduttori ad alta frequenza è stata applicata per valutare i cambiamenti emodinamici in questo studio. La RVSV è stata stimata dal flusso sanguigno polmonare VTI ed è aumentata di circa il 30%-40% entro 2 mesi dall'intervento chirurgico nei topi VO postnatali. Questi risultati hanno ulteriormente dimostrato il successo dell'affermazione di AVF e RV VO in questo modello.
Il VO cronico può gradualmente portare a una resistenza polmonare funzionalmente elevata e, infine, a un rimodellamento vascolare delle arteriole PA. Questo processo è comune nei bambini con CHD con uno shunt da sinistra a destra. Precedenti studi su animali in pecore e suinetti hanno dimostrato che la FAV potrebbe portare a cambiamenti strutturali e funzionali nel sistema vascolare polmonare 13,24,25. Durante il successivo follow-up a 2 mesi dopo l'intervento chirurgico, sono stati osservati modelli morfologici anomali del flusso PA Doppler con diminuzione della PAT, rigurgito della valvola polmonare e una tendenza al ribasso di RVSV nei topi VO. Come riportato in precedenza, la PAT può essere utilizzata come parametro complementare per valutare il postcarico del ventricolo destro nei neonati e nei bambini. I fenomeni sopra menzionati possono suggerire un'alterata resistenza vascolare polmonare nei topi VO26,27,28. Per quantificare l'elevato postcarico del ventricolo destro o il sovraccarico di pressione, il rapporto tra PAT e RVET è stato utilizzato per stimare il valore di RVSP utilizzando la formula verificata da Thibault nel topo adulto18, che ha dimostrato che il RVSP era significativamente aumentato 2 mesi dopo l'intervento chirurgico di AVF nel modello postnatale. Inoltre, l'evidenza istopatologica dell'infiammazione e del rimodellamento PA in diversi lobi polmonari di topi VO ha ulteriormente dimostrato le anomalie strutturali 3 mesi dopo l'intervento chirurgico. Pertanto, per escludere l'effetto del sovraccarico di pressione, è stato suggerito che l'applicazione di questo modello di RV VO di topi postnatali fosse limitata a 2 mesi dopo l'intervento chirurgico.
In sintesi, la chirurgia AVF modificata è una tecnica fattibile per stabilire il modello RV VO nei topi postnatali. Considerando la probabilità di chiusura della fistola e l'elevata resistenza dell'arteria polmonare, è necessario eseguire un'ecografia addominale e un'ecocardiografia per confermare lo stato del modello prima dell'applicazione.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation of China (n. 82200309) e dall'Innovation Project of Distinguished Medical Team di Ningbo (n. 2022020405)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Tiandz,Chia | ||
| ACETAMINOPHEN Oral Solution | VistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USA | NDC 66689-054-01 | |
| Anesthesia machine | RWD Life Science,China | R550IP | |
| Anesthesia mask | RWD Life Science,China | 68680 | |
| C57BL/6 mice | Xipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China) | ||
| Hair removal cream | Veet, France | VT-200 | |
| Hematoxylin and eosin Kit | Beyotime biotech | C0105M | |
| Isoflurane | RWD Life Science,China | R510-22-10 | |
| Microscope | Yuyan Instruments, China | SM-301 | |
| Surgical suture needles | NINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China | ||
| Thermostatic heating platform | Qingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China | ||
| Ultrasound device | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | Image modes includes B-Mode, Color Doppler Mode and Pulsed Wave Doppler Mode |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories,United States | REF 01-08 | |
| Ultrasound transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS 400 |
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